1. Spektroskopia
- nauka o powstaniu i interpretacji widm powstajacych w wyniku oddzialywan wszelkich rodzajow promieniowania na materie rozumiana jako zbiorowisko atomow i czasteczek. Spektroskopia jest tez czesto rozumiana jako ogolna nazwa wszelkich technik analitycznych polegajacych na generowaniu widm.
I_0 - natezenie swiatla padajacego
I - natezenie swiatla po przejsciu przez absorbujacy osrodek
- W procesie absorbcji swiatlo zachowuje sie jak strumien czasteczek elementarnych i moze byc pochlaniane tylko w okreslonych porcjach, ktorych wielkosc zalezy od czestotliwosci swiatla ν.
E = hν
, gdzie h - stala Plancka
Kwant swiatla, czyli foton niosacy te okreslona porcje energii moze oddzialywac z elektronem walencyjnym w atomie substancji osrodka. Jezeli energia fotonu rowna jest roznicy energii pomiedzy dowolnym stanem wzbudzonym elektronu a stanem podstawowym, wowczas foton zostanie pochloniety (nastepuje absorpcja fotonu). Gdy energia fotonu jest inna, wowczas albo przechodzi on przez substancje bez przeszkod, albo jest rozpraszany. na skutek absorbacji fotonu atom przechodzi w stan wzbudzenia o wyzszej energii. Wzbudzone atomy powracaja do stanu podstawoweggo emitujac foton o takiej samej lub mniejszej energii. Zmniejszenie energii emitowanego fotonu w porownaniu z energia fotonu absorbowanego nosi nazwe luminescencji.
Podstawa spektrofotometrii absorpcyjnej w badaniach roztworow jest prawo Bouguera-Lamberta-Beera (Beera-Waltera), okreslajace liniowa zaleznosc absorbancji od stezenia:
A = log
I
I_t
0 = ε c l
, gdzie A - absorbancja, ε - molowy wspolczynnik absorpcji, c - stezenie , l - grubosc warstwy absorbujacej.
Prawo to spelnione jest dla roztworow rozcienczonych. W przypadku stezonych roztworow obserwuje sie odstepstwa od liniowosci, wynikajace z nakladania sie przekrojow czynnych obiektow absorbujacych promieniowanie badz w wyniku tworzenia sie asocjatow, polimerow lub dodatkowych oddzialywan.
Wychodzaca ze zrodla promieniowania wiazka zostaje rozszczepiona przez monochromator (siatka dyfakcyjna , rzadziej pryzmat) na poszczegolne fale, tworzac uporzadkowane wedlug dlugosci fali continuum. Z tego continuum szczelina wycina wiazke o bardzo waskim zakresie dlugosci fal, tak, ze traktowac ja mozemy jako wiazke monochromatyczna (zawierajaca tylko jedna dlugosc fali) o natezeniu I_0. po przejsciu tej "monochromatycznej" wiazki przez badany roztwor , traci ona na natezeniu , bowiem czesc jej energii zostala zaabsorbowana przez obecne w badanym zwiazku elektrony walencyjne. Po przejsciu przez roztwor wiazka ma natezenie I_x. Stosunek natezenia wiazki po przejsciu przez absorbujace srodowisko do natezenia wyjsciowego, wyrazony w procentach nazywamy transmitancja T=I_x/I_0. Drugim waznym pojeciem zwiazanym z pochalnianiem energii promieniestej przez substancje jest pojecie absorbancji (A), ktora definiujemy jako logarytm dziesietny z odwrotnosci transmitnacji.
transmitancja T = I_x/I_0
absorbancja A = lg 1/T = lg I_0/I_x
Zatem, jesli badany roztwor pochlanie 90% promieniowania o danej dlugosci fali, to powiemy, ze jego transmitancja przy tej dlugosci dali wynosi 10%, zas absorbancja bedzie wynosic lg(100/10)=1
Poniewaz podstawowe prawa spektroskopii zwiazane z nazwiskami odkrywcow - Lamberta, Beera i Waltera, mowia, ze proporcjonalne zaleznosci zachodza miedzy stezeniem, gruboscia warstwy absorbujacej i absorbancja, ta ostatnia jest czesciej uzywana w praktyce, nie nalezy jednak zapomniec, co ona de facto oznacza. Bedaca dzis standardem gorna granica pracy spektofotometrow pozwalajaca oznaczac do wartosci abdorbancji rownej 2, oznacza , ze aparat jest wstanie mierzyc wiarygodnie natezenia promieniowania 100-krotnie slabszego niz wychodzace ze zrodla. Absorbancja rowna 3, jako gorna granica mozliwosci aparatu, oznacza juz mozliwosc pomiaru promieniowania oslabionego 1000-krotnie.
Budowa spektrofotometru:
- zrodlo promieniowania
-wiazka promieniowania
- monochromator
-szczelina
-przeslona
- wiazka "monochromoatyczna
- wiazka zwieciadlo sektorowe
-kuweta z probka badana
-kuweta z probka odniesienia
Wiazka promieniowania ze zrodla trafia do monochromatora, gdzie zostaje rozszczepiona, a nastepnie przechodzac przez waska szczeline (fizycznie - ulamek milimetra) staje sie wiazka prawie monochromatycznej" wiazki nie przekraczaja w dobrych spektofotometrach ulamka nanometra ( w popularnych, tanich przyrzadach osiagaja wielkosc do kilku nanometrow).
nastepnia wiazka trafia na wirujace zwierciadlo sektorowe, ktore okresowo zmienia jej bieg. Jesli trafi na sektor ze zwierciadlem, biegnie dalej droga przez kuwete z probka odniesienia ("slepa proba") i dalej do detektora mierzacego natezenie wiazki. Jesli trafi na sektor pusty, biegnie droge prowadzaca przez probke badana i dalej do detektora. Detektor otrzymujac kolejne sygnaly o natezenie wiazki przechodzacej przez probke odniesienia, ktore traktuje jako 100% natezenia, i probke badana, oblicza absobancje roztworu badanego. Poniewaz "slepa proba" najczesciej rozni sie od probki badanej tylko tym, ze nie zawiera nalitu (czyli substancji oznaczanej), obliczona absorbancja dotyczy tylko mierzonego analitu. Rejestrujac wartosci absorbancji w funkcji zmieniajacej sie dlugosci fali przechodzacej przez roztwor otrzymujemy widmo. Zmiany dlugosci fali najczesciej uzyskuje sie mieniajac w sposob ciagly i automatyczny kat monochromatora w stosunku do padajacej nan wiazki ze zrodla promieniowania.
2.
Aby zmierzyc aktywnosc enzymu i czy wyizolowanym bialkiem jest szukany przez nas enzym - lizozym. Zmierzylismy absorbancji po dodaniu wizolowanego bialko do populacji bakterii gram (+) za pomoca spektofotometru.
Spektrofotometria - technika spektroskopowa podlegajaca na ilosciowym pomiarzem absorbancji emisji lub odbicia swiatla.
Absorancja - jest to proces pochlaniania energii fali elektromagnetycznej przez sekwencje definiowana jako logarytm dziesietny z odwrotnoscia transmisji
Transmisji - zas jako stosunek natezenia wiazki po przejsciu przez absorbujace srodowisko do natezenia wyjsciowego.
Przechodzac do samej spektofotmetrii
Wychodzace ze zrodla promieniowania wiazka zostaje rozszczepiona przez monochromator (siatka dyfrakcyjna, rzadziej pryzmat) na poszczegolne fale, tworzac uporzadkowany wg. dlugosci fali continuum. Z tego continuum szczelina wyczna wiazke o dlugosci fal, tak, ze traktowac ta mozemy jako wiazke monochromatyczna (zawierajaca tylko jedna dlugosc fali - 450nm) o natezeniu I_0. Nastepnie wiazka trafia na wirujace zwierciadlo sektorowe, ktore okresowo zmienia jej bieg. Jezeli trafia na sektor ze zwierciadlem, biegnie dalej droga przez kuwete z proba odniesienia "slepa proba" i dalej do detektor mierzenia natezenia wiazki. Jesli trafi na sektor pusty, biegnie droge prowadzaca przez probke badana i dalej do detektora. Detektor otrzymujac kolejne sygnaly o natezeniu wiazki przechodzacej przez probke odniesienia , ktore traktuje jako 100% natezenia i probke badana, oblicza absorbancje roztworu badanego.
Przejdzmy do wynikow ktore otrzymalismy (Przechodzac do wynikow).
Do kuwety dodalismy roztworu 0,2 mg gram (t) bakterii Miccrococcus Lysodeikticus w ml wody.
Przy tym roztworze absorbancja wynosila ok 1,45. w czasie trwanie pomiaru nastapily 3 gwaltowne zmiany absorbancji, spowodowane dodaniem poszczegolnych frakcji:
1) Pierwsza oczyszczona frakcja bialka
2) Frakcja kolumne dodatkowo przemyta buforem podstawowym
3) Frakcja kolumna dodatkowo przemyta buforem pod z 2 M sole octanu amonu
- gwaltowne spadki byly spowodowane rozcienczeniem
- zas wzrosty prawdopodobnie przyslonieciem wiazki pomiarowej koncowke pipety.
Po dodaniu kolejnych frakcji i ustabilizowane nastepowal sukcesywny spadek absorbancji lecz o roznym nasileniu.
- najslabiej (prawie wogole) spadla absorbancja po dodaniu 1 frakcji, a zdecydowanie szybciej po dodaniu 3
- spadek absorbancji jest w tym momencie rownowazny ze spadkiem licznosci populacji bakterii -> spowodowanej dodaniem enzymu
- spadek jest tym intesywniejszy im wieksze jest ilosc aktywnego bialka
- poprzemyciu kolumny jonowymiennej buforem z 2 M sola uzyskoliszny najwieksza ilosc bialka (enzymu)
-nasz pomiar trwal niecale 300 s - to jest 5 min. Absorbanuje spadla z 1,45 do 0,6. Jes to ilosc dlugo jak na enzym. Lizozym jest 1 z najwolniejszych enzymow znanych biochemii.
Wizolowanie bialko to lizoym , swiadczy o tym:
-spadek absorbancji podczas spektrofotometrii a co za tym idzie spadek ilosci bakterii
- co zmniejszonia absorbancji
- to wogole przemieszczal sie przez kolumne jonowymienna
- nauka o powstaniu i interpretacji widm powstajacych w wyniku oddzialywan wszelkich rodzajow promieniowania na materie rozumiana jako zbiorowisko atomow i czasteczek. Spektroskopia jest tez czesto rozumiana jako ogolna nazwa wszelkich technik analitycznych polegajacych na generowaniu widm.
I_0 - natezenie swiatla padajacego
I - natezenie swiatla po przejsciu przez absorbujacy osrodek
- W procesie absorbcji swiatlo zachowuje sie jak strumien czasteczek elementarnych i moze byc pochlaniane tylko w okreslonych porcjach, ktorych wielkosc zalezy od czestotliwosci swiatla ν.
E = hν
, gdzie h - stala Plancka
Kwant swiatla, czyli foton niosacy te okreslona porcje energii moze oddzialywac z elektronem walencyjnym w atomie substancji osrodka. Jezeli energia fotonu rowna jest roznicy energii pomiedzy dowolnym stanem wzbudzonym elektronu a stanem podstawowym, wowczas foton zostanie pochloniety (nastepuje absorpcja fotonu). Gdy energia fotonu jest inna, wowczas albo przechodzi on przez substancje bez przeszkod, albo jest rozpraszany. na skutek absorbacji fotonu atom przechodzi w stan wzbudzenia o wyzszej energii. Wzbudzone atomy powracaja do stanu podstawoweggo emitujac foton o takiej samej lub mniejszej energii. Zmniejszenie energii emitowanego fotonu w porownaniu z energia fotonu absorbowanego nosi nazwe luminescencji.
Podstawa spektrofotometrii absorpcyjnej w badaniach roztworow jest prawo Bouguera-Lamberta-Beera (Beera-Waltera), okreslajace liniowa zaleznosc absorbancji od stezenia:
A = log
I
I_t
0 = ε c l
, gdzie A - absorbancja, ε - molowy wspolczynnik absorpcji, c - stezenie , l - grubosc warstwy absorbujacej.
Prawo to spelnione jest dla roztworow rozcienczonych. W przypadku stezonych roztworow obserwuje sie odstepstwa od liniowosci, wynikajace z nakladania sie przekrojow czynnych obiektow absorbujacych promieniowanie badz w wyniku tworzenia sie asocjatow, polimerow lub dodatkowych oddzialywan.
Wychodzaca ze zrodla promieniowania wiazka zostaje rozszczepiona przez monochromator (siatka dyfakcyjna , rzadziej pryzmat) na poszczegolne fale, tworzac uporzadkowane wedlug dlugosci fali continuum. Z tego continuum szczelina wycina wiazke o bardzo waskim zakresie dlugosci fal, tak, ze traktowac ja mozemy jako wiazke monochromatyczna (zawierajaca tylko jedna dlugosc fali) o natezeniu I_0. po przejsciu tej "monochromatycznej" wiazki przez badany roztwor , traci ona na natezeniu , bowiem czesc jej energii zostala zaabsorbowana przez obecne w badanym zwiazku elektrony walencyjne. Po przejsciu przez roztwor wiazka ma natezenie I_x. Stosunek natezenia wiazki po przejsciu przez absorbujace srodowisko do natezenia wyjsciowego, wyrazony w procentach nazywamy transmitancja T=I_x/I_0. Drugim waznym pojeciem zwiazanym z pochalnianiem energii promieniestej przez substancje jest pojecie absorbancji (A), ktora definiujemy jako logarytm dziesietny z odwrotnosci transmitnacji.
transmitancja T = I_x/I_0
absorbancja A = lg 1/T = lg I_0/I_x
Zatem, jesli badany roztwor pochlanie 90% promieniowania o danej dlugosci fali, to powiemy, ze jego transmitancja przy tej dlugosci dali wynosi 10%, zas absorbancja bedzie wynosic lg(100/10)=1
Poniewaz podstawowe prawa spektroskopii zwiazane z nazwiskami odkrywcow - Lamberta, Beera i Waltera, mowia, ze proporcjonalne zaleznosci zachodza miedzy stezeniem, gruboscia warstwy absorbujacej i absorbancja, ta ostatnia jest czesciej uzywana w praktyce, nie nalezy jednak zapomniec, co ona de facto oznacza. Bedaca dzis standardem gorna granica pracy spektofotometrow pozwalajaca oznaczac do wartosci abdorbancji rownej 2, oznacza , ze aparat jest wstanie mierzyc wiarygodnie natezenia promieniowania 100-krotnie slabszego niz wychodzace ze zrodla. Absorbancja rowna 3, jako gorna granica mozliwosci aparatu, oznacza juz mozliwosc pomiaru promieniowania oslabionego 1000-krotnie.
Budowa spektrofotometru:
- zrodlo promieniowania
-wiazka promieniowania
- monochromator
-szczelina
-przeslona
- wiazka "monochromoatyczna
- wiazka zwieciadlo sektorowe
-kuweta z probka badana
-kuweta z probka odniesienia
Wiazka promieniowania ze zrodla trafia do monochromatora, gdzie zostaje rozszczepiona, a nastepnie przechodzac przez waska szczeline (fizycznie - ulamek milimetra) staje sie wiazka prawie monochromatycznej" wiazki nie przekraczaja w dobrych spektofotometrach ulamka nanometra ( w popularnych, tanich przyrzadach osiagaja wielkosc do kilku nanometrow).
nastepnia wiazka trafia na wirujace zwierciadlo sektorowe, ktore okresowo zmienia jej bieg. Jesli trafi na sektor ze zwierciadlem, biegnie dalej droga przez kuwete z probka odniesienia ("slepa proba") i dalej do detektora mierzacego natezenie wiazki. Jesli trafi na sektor pusty, biegnie droge prowadzaca przez probke badana i dalej do detektora. Detektor otrzymujac kolejne sygnaly o natezenie wiazki przechodzacej przez probke odniesienia, ktore traktuje jako 100% natezenia, i probke badana, oblicza absobancje roztworu badanego. Poniewaz "slepa proba" najczesciej rozni sie od probki badanej tylko tym, ze nie zawiera nalitu (czyli substancji oznaczanej), obliczona absorbancja dotyczy tylko mierzonego analitu. Rejestrujac wartosci absorbancji w funkcji zmieniajacej sie dlugosci fali przechodzacej przez roztwor otrzymujemy widmo. Zmiany dlugosci fali najczesciej uzyskuje sie mieniajac w sposob ciagly i automatyczny kat monochromatora w stosunku do padajacej nan wiazki ze zrodla promieniowania.
2.
Aby zmierzyc aktywnosc enzymu i czy wyizolowanym bialkiem jest szukany przez nas enzym - lizozym. Zmierzylismy absorbancji po dodaniu wizolowanego bialko do populacji bakterii gram (+) za pomoca spektofotometru.
Spektrofotometria - technika spektroskopowa podlegajaca na ilosciowym pomiarzem absorbancji emisji lub odbicia swiatla.
Absorancja - jest to proces pochlaniania energii fali elektromagnetycznej przez sekwencje definiowana jako logarytm dziesietny z odwrotnoscia transmisji
Transmisji - zas jako stosunek natezenia wiazki po przejsciu przez absorbujace srodowisko do natezenia wyjsciowego.
Przechodzac do samej spektofotmetrii
Wychodzace ze zrodla promieniowania wiazka zostaje rozszczepiona przez monochromator (siatka dyfrakcyjna, rzadziej pryzmat) na poszczegolne fale, tworzac uporzadkowany wg. dlugosci fali continuum. Z tego continuum szczelina wyczna wiazke o dlugosci fal, tak, ze traktowac ta mozemy jako wiazke monochromatyczna (zawierajaca tylko jedna dlugosc fali - 450nm) o natezeniu I_0. Nastepnie wiazka trafia na wirujace zwierciadlo sektorowe, ktore okresowo zmienia jej bieg. Jezeli trafia na sektor ze zwierciadlem, biegnie dalej droga przez kuwete z proba odniesienia "slepa proba" i dalej do detektor mierzenia natezenia wiazki. Jesli trafi na sektor pusty, biegnie droge prowadzaca przez probke badana i dalej do detektora. Detektor otrzymujac kolejne sygnaly o natezeniu wiazki przechodzacej przez probke odniesienia , ktore traktuje jako 100% natezenia i probke badana, oblicza absorbancje roztworu badanego.
Przejdzmy do wynikow ktore otrzymalismy (Przechodzac do wynikow).
Do kuwety dodalismy roztworu 0,2 mg gram (t) bakterii Miccrococcus Lysodeikticus w ml wody.
Przy tym roztworze absorbancja wynosila ok 1,45. w czasie trwanie pomiaru nastapily 3 gwaltowne zmiany absorbancji, spowodowane dodaniem poszczegolnych frakcji:
1) Pierwsza oczyszczona frakcja bialka
2) Frakcja kolumne dodatkowo przemyta buforem podstawowym
3) Frakcja kolumna dodatkowo przemyta buforem pod z 2 M sole octanu amonu
- gwaltowne spadki byly spowodowane rozcienczeniem
- zas wzrosty prawdopodobnie przyslonieciem wiazki pomiarowej koncowke pipety.
Po dodaniu kolejnych frakcji i ustabilizowane nastepowal sukcesywny spadek absorbancji lecz o roznym nasileniu.
- najslabiej (prawie wogole) spadla absorbancja po dodaniu 1 frakcji, a zdecydowanie szybciej po dodaniu 3
- spadek absorbancji jest w tym momencie rownowazny ze spadkiem licznosci populacji bakterii -> spowodowanej dodaniem enzymu
- spadek jest tym intesywniejszy im wieksze jest ilosc aktywnego bialka
- poprzemyciu kolumny jonowymiennej buforem z 2 M sola uzyskoliszny najwieksza ilosc bialka (enzymu)
-nasz pomiar trwal niecale 300 s - to jest 5 min. Absorbanuje spadla z 1,45 do 0,6. Jes to ilosc dlugo jak na enzym. Lizozym jest 1 z najwolniejszych enzymow znanych biochemii.
Wizolowanie bialko to lizoym , swiadczy o tym:
-spadek absorbancji podczas spektrofotometrii a co za tym idzie spadek ilosci bakterii
- co zmniejszonia absorbancji
- to wogole przemieszczal sie przez kolumne jonowymienna
Komentarze
Prześlij komentarz