1. Inzynieria genetyczna
a) Informacja genetyczna
- przekonowany z pokolenia na pokolenie zapis o jakiejs cesze lub cechach organizmu.
b) historia
- poczatek XX - byly wszystkie podstawowe skladniki organiowane komorki - bialka, lipidy, cukry i kwasy nukleinowe.
-lata 20 XX w. Fredrick Griffith
* przeprowadzil doswiadczenie, dzieki ktoremu w dosc prosty sposob dowrocil przekazywane informacji genetycznej. Wykorzystal 2 szczepy dwoinki zapalenia pluc
** zjadliwy - wywoluje u myszy zapalenia pluc
** maja charakterystyczne "sluzowe" otoczki
* lagodny
** nie wywoluje u myszy zapalenia pluc
** brak otoczki
-Griffith podawal bakterie zjadliwe (z otoczkami) oraz bakterie lagodne (nie majace otoczek). Stwierdzil wowczas miedzy innymi.
1673 - Hde Graaf - podal ze odkryl komorek jajowych ssaka (pecherzyk Grafa
1673 - K. Baer - odkryl wlasciwy oocyt
1673 - A. Leevenhoek - plemnik
1673 - R. runnett
1865 - J. G. Mendel i kolpurskularna teoria dziejow
1900 - C. correns, E. Tschermak, H. de Vries - narodziny genetyki, niezalezne powtorzyc doswiadczenie Mendla
1902 - A. Garrad
1909 - W. Johannsen
Poster obalil teorie samorobctwa
1910-1914 - T. Morgan i inni i katalizacja genow w chromosomie
1944 - O. T. A Very i inni : DNA nosnikiem informacje genetyczny
1953 - J. Watson i F. Crlilk: model budowy DNA
1966 - G. Khorana i inni : odczytanie kodu genetycznego
od 1970 - zastosowanie enzymow restrykcyjnych do ciecia DNA
1975 - konferencja w Asilomor (USA) na temat manipulacji genetycznych , tak manipulowac by nie mogly przezyc na wolnosci
1980 - pierwsze zwierzeta transgeniczne
1997 - pierwszy sklonowany ssak (Dolly)
1998 - pierwszy w calosci zmapowany chromosom czlowieka (22)
2000 - zskwencjonowany genom czlowieka
2. Inzynieria genetyczna - narzedzia i metody
2.1 Specjalne nukleazy bronia komorke bakterii przed atakiem fagow.
Enzymy niszczace czasteczki kwasow nukleinowych nazywamy ogolnie nukleazami. U bakterii wystepuja specjalne nukleazy, ktore niszcza w komorce obce czasteczki DNA.
Genom bakteryjn jest zabezpieczony przed dzialaniem takich enzymow poprzez swoista modyfikacje Dna: do pierscienia niektorych aadenin i cytozyn jest przyloczona dodatkowa grupa metylowa (-CH_3). Modyfikacja taka, zwana metylacja DNA, zabezpiecza chromosom bakteryjny przed dzialaniem nukleaz wystepujacych w komorce.
Zasadnicza rola enzymow niszczacych obcy DNA jest ochrona bakterii przed atakiem bakteriofagow, czyli wirusow komorek bakteryjnych, zwanych inaczej fagami. Jezeli fagi zdolaly zainfekowac katerie i wprowadzily do jej wnetrza swoj material genetyczny, zostanie on blyskawicznie rozpoznany i skutecznie zniszczony przez odpowiednie enzymy. Komorka moze wtedy dalej zyc i dzielic sie. Jezeli system zawiedzie, zainfekowana bakteria stanie sie "inkubatorem" nowych bakteriofagow, wczesniej lub pozniej zostanie przez nie zniszczona i uwolni tysiace nowych czastek fagowych.
Specjalne nukleazy, ktore walcza w komorkach bakterii z DNA bakteriofagow nazywano enzymami restrykcyjnymi (restryktazami).
2.2 Restryktazy rozcinaja DNA w scisle okreslonych miejscach.
Na poczatkach lat siedemdziesiatych udalo sie wyizolowac z komorek bakterii pierwsze enzymy restrykcyjne. dokladne badania laboratoryjne wykazaly, ze sa one nizwykle precyzyjne w swoim dzialaniu. Kazda z restryktaz rozpoznaje okreslona, krotka sekwencje nukleotydowa, przylacza sie do niej , a nastepnie rozcina czasteczek DNA tylko w odrebie rozpoznanej sekwencji. jezeli miejsc takich jest kilka , to enzym tnie czasteczke DNa tylko w obrebie rozpoznanej sekwencji. Jezeli miejsc takich jest kilka, to enzym tnie czasteczke DNa na odpowiednia liczbe mniejszych fragmentow. Wiekszosc enzymow restrykcyjnych rozpoznaje cztero- lub szescionukleotydowe sekwencje palindromowe; niektore z nich rozpoznaja dluzsze sekwencje. Na pewno wiecie, ze palindromy to lowa lub zdania , ktore czytane od poczatku do konca oraz wspak maja identyczne znaczenie (na przyklad KAJAK lub zdanie KOBYLA MA MALY BOK). sekwencja palindromowa w przypadku DNA ma identyczna kolejnosc zasad na jedenj i na drugiej nici, na przyklad
5' - AACGTT - 3'
3' - TTGCAA - 5'
Jezeli przeczytacie kazda z nic tej czasteczki w kierunku 5' -> 3', to otrzymacie w obu przypadkach identyczna sekwencje. AACGTT.
Niektore restryktazy rozcinaja obie nici DNA symetrycznie, a niektore nacinaja jedna nic czasteczki w jednym miejscu, a druga kilka nukleotydow dalej. W wyniku takiego asymetrycznego rozciecia czasteczki DNA produkty reakcji maja wystajace, jednoniciowe odcinki. Konce z takimi jednoniciowymi fragmentami nazywamy lepkimi, natomiast powstale w wyniku rozciecia symetrycznego nazywamy tepymi.
Przyklady sekwencji nukleotydowych rozpoznawanych i przecinanych przez enzymy restrykcyjne
a) lepkie konce
5' ... GAATTC ... 3' 5' ... G AATTC ... 3'
- restryktaza EcoRI ->
3' ... CTTAAG ... 5' 3' ... CTTAA G ... 5'
b) tepe konce
5' ... GTTAAC ... 3' 5' ... GTT AAC ... 3'
- restryktaza HhaI ->
3' ... CAATTG ... 5' 3' ... CAA TTG ... 5'
Poszczegolnym enzymom restrykcyjnym nadawano nazwy nawiazujace do szczepow bakteryjnych , z kyotych je wyizolowano. Poniewaz z jednego szczepu bakteryjnego izolowano kilka restryktaz, kazda nastepna oznaczano kolejnym numerem ( na przyklad enzym EcoRI to pierwszy enzym wyizolowany ze szczepu R paleczki okreznicy E. coli , a HindIII to trzecia resryktaza wyizolowana ze szczepu d bakterii Haemophilus influenzae).
Wszystkie enzymy restrykcyjne maja trzy przydatne wlasciwosci. Po pierwsze , dzialaja in vitro, czyli poza komorka bakteryjna (w probowce). Po drugie, rozpoznaja z taka sama precyzja czasteczki DNA wyizolowane z bakteriofaga, czlowieka lub pszenicy. I wreszccie po trzecie, dzialaja powtarzalnie, czyli konkretny enzym rozcina zawsze czasteczke DNA tylko w jednen charakterystyczny sposob (liczba rozciec zalezy od jej sekwencji). To wlasnie te trzy cechy restryktaz spowodowaly , ze staly sie one podstawowym narzedziem biologii molekuralnej. Pozwolily bowiem na swobodna manipulacje materialem genetycznym pochodzacym z roznych organizmow, czyli na dzialania, ktore dzisiaj nazywamy inzynierie genetyczna.
2.3 Elektroforeza zelowa pozwala na rozdzial fragmentow Dna za wzgledu na ich wielkosc.
Po rozcieciu dlugich czasteczek DNA na mniejsze, otrzymane fragmenty nalezy rozdzielic, aby wybrac fragment, ktory zamierzamy poddac dokladnym badaniom. Zwykle wykorzystuje sie do tego celu elektroforeze zelowa. Elektroforeza to rozdzial bialek DNA, RNA lub innych czasteczek za pomoca pola elektrycznego. Elektroforeza, ktora tam opisalismy, prowadzona byla w ultracienkiej rurce - kapilarze. Teraz zajmiemy sie elektroforeza prowadzona w plytce zelowej. Plytka taka przypomina zastygla owocowa galaretka, wylana do plaskiego, prostokatnego pudelka. Po wyjeciu galertki otrzymujemy "plaster" grubosci 0,5-1 cm, ktory do zludzenia przypomina zel uzywany w laboratorium do rozdzialu fragmentow DNA . Galaretka jest zlozona z agarozy. Jeszcze przed zastygnieciem agarozy wklada sie do niej dodatkowa forme (tak zwany grzebien), ktora pozniej, po usunieciu pozostawi na powierzchni zelu charakterystyczne zaglabienie - studzienki . Przygotowany w ten sposob zel jest umieszczany w naczyniu elektroforetycznym, wypelnionym odpowiednim buforem. Bufor - roztwor slabych kwasow i ich soli z mocnymi zasadami lub slabych zasadach i ich soli z niemocnymi kwasami, utrzymujac stala kwasowosc lub zasadowsc osrodka. Mieszanine fragmentow DNA wklada sie do studzienki w plytce zelu. Po obu stronach naczynia elektroforetycznego umieszcza sie elektrody podlaczone do zrodla pradu stalego. Poniewaz czasteczki DNA znajdujace sie w roztworze o pH 8-9 maja ladunkek ujemny (zze wzgledu na obecnosc grup fosforanowych, od ktorych oddysocjowuja protony), pod wplywem napiecia poruszaja sie w kierunku od biegu na ujemnego do dodatniego. Podczas migracji rozdzielaja sie ze wzgledu na zroznicowana dlugosc: mniejsze fragmenty z latwoscia przechodza przez kanaliki w zelu i migruja znacznie szybciej , natomiast wieksze przyciskaja sie przez nie z trudem, dlatego ich wedrowka trwa o wiele duzej. Po zakonczonej elektroforezie zel z rodzielonymi fragmentami traktowany jest odpowiednim barwnikiem i obserwowany w swietle UV. Barwnik przedostaje sie sie miedzy zasady DNA i pod wplywem promieniowania UV emituje swiatlo widzialne. Poszczegolne fragmenty DNA sa widoczne w zelu w postaci wyraznych , "swiecacych" prazkow . Kazdy prazek stanowi kolekcje odcinkow DNA o identycznej dlugosci. Jezeli chcielibysmy wyizolowac ktorys z nich, wystarczy wyciac skalpelem lub zyletka odpowiednik kawalek zelu i wyizolowac z niego interesujacy nas fragment.
2.4 Fragmenty DNA wprowadza sie do czasteczek zwanych wektorami.
Fragmenty DNA izolujemy najczesciej po to, aby wlaczyc je do specjalnej czasteczki DNA, ktora nazywamy wektorem. Wektory sa czasteczkami DNA , ktore pozwalaja na wprowazenie okreslonego frgamentu DNa do wnetrza komorki, najczesciej bakteryjnej, ale takze do komorki drozdzy, ludzkiej lub roslinnej. Oczywiscie, w kazdym z wymienionych przypadkow bedziemy musieli zastosowac inny wektor.
Wektory sa najczesciej plazmidy, czyli male koliste czasteczki Dna wystepujace u bakterii. Jak wiecie, plazmidy wystepuja w komorce w wielu kopiach (powielaja sie niezaleznie od chromosomu bakteryjnego). Maja one miejsce ori, czyli rejon umozliwiajacy rozpoczecie replikacji DnA, oraz gen opornosci na okreslony antybiotyk, nazywany genem markerowym. Komorki bakterii, ktora ma plazmid z takim genem, jest oporna na dzialanie antybiotyku, poniewaz produkt genu markerowego rozklada go lub tez w inny sposob uniemozliwia jego szkodliwe dzialanie.
Pomyslcie tylko, jezeli do plazmidu zostalby wprowadzony dodatkowy fragment DNA, to w komorkach bakterii bedzie on replikowany wraz z czasteczka plazmidowa. Kazda kopia zmodyfikowanego plazmidu bedzie zawierala zintegrowany z nim odcinek obcego DNA.
Poniewaz plazmid jest czasteczka kolista, przed wprowadzeniem do niego fragmentu DNa nalezy go odpowiednio przygotowac. Przede wszystkim trzeba znalezc restryktaze, ktora rozetnie czasteczke wektora tylko w jednym miejscu, tworzac z kolistego plazmidu czasteczke liniowa. Wazne jest rozniez, aby konce rozcietej czasteczki wektroa byly podobne do koncow wlaczanego fragmentu DNA. Jezeli obie czasteczki, ktore maja byc polaczone, bede mialy tepe konce, polacza sie ,nienaleznie od tego, jaki enzym je pozostawil (na przyklad wektor moze byc rozciety enzymem Kpn1, a fragment DNA - EcoRV; oba enzymy po rozcieiciu czasteczkiDNA pozostawiaja tepe konce). Jesli jednak chcemy zastosowac enzym, ktory po cieciu tworzy tak zwane lepkie konce, to nalezy pamietac, ze obie czasteczki musze byc przeciete tym samym enzymem (na przyklad EcoR1). Tylko wtedy wystajace, jednoniciowe odcinki wektora odnajda komplementarna sekwencje na koncach fragmentu DNa.
Enzymem, ktory laczy czasteczke wektora z odpowiednim fragmentem, jest ligaza DNA . Dzieki ligazie obie czasteczki DNA . Otrzymany plazmid jest nazywany plazmidem zrekombinowanym, poniewaz zawiera dodatkowy odcinek DNA. Laczenie z soba roznych czasteczek DNA nazywamy rekombinacja in vitro.
2.5 Zrekombinowane plazmidy wprowadza sie do komorek bakeryjnych
Plazmidy
2.6 Bibliotek genomowa to kolekcja zrekombinowanych wektorow, ktora zawiera wszystkie fragmenty genomu.
2.7 Hybrydyzacja to utworzenie wiazan wodorowych miedzy nicmi DNA o komplementarnej sekwencji.
2.8 Techniki hybrydyzacyjne pozwalaja zidentyfikowac fragment DNa o okreslonej sekwencji.
3. Zastoswoanie inzynierii genetycznej
3.1 Insulina jest hormonem peptydowym syntetyzowanym przez wyspecjalizowane komorki trzustki.
3.2 Poziom glukozy we krwi jest precyzyjnie kontrolowany przez antagonistyczne dzialanie insuliny i glukagonu.
3.3 Najczesciej wystepujacym efektem zaburzen w czynnosci hormonow trzustki jest cukrzyca.
3.4 Insulina jest syntetyzowana w postaci czasteczki prekursorowej.
3.5 Insulina jes t syntetyzowana w postaci prekursorowej.
3.6 Wieloletnie stosowanie insuliny zwierzecej moze byc dla pacjenta niebezpieczne
3.7 Wektory ekspresyjne zawieraja promotory i terminatory transkrypcji.
3.8 Ludzka insulina moze byc produkowana w komorkach bakterii.
3.9 Enzym odwrotna transkryptaza potrafi przepisac mRNA na DNA.
3.10 Produkowane w komorkach prokariotycznych bialka eukariotyczne czesto nie moga przyjac prawidlowej struktury drugo- i trzeciorzedowej.
3.11 Insuline produkuje sie takze w komorkach drozdzy piekarniczych Saccharomyces cerevisiae.
3.12 Produkcja insuliny w komorkach ssakow jest zbyt droga.
3.13 W bakteriach mozna rowniez wyprudukowac somatropine
4. Choroby genetyczne
4.1
a) Genopatie
- anomalie wynikajace z dziedziczeniach pojedynczych zmutowanych alleli
b) Genomopatie
- mutacje w obrebie genomu
c) Mitochondrialne ( w mitochondrium)
4.2
- Choroby zwiazane z zaburzeniami enzymow aromatycznych m. in. egzogenne - w nadmiarze nalezy je rozlozyc. Blok metabolicznych powstaje w momencie niemozliwosci rozkladania bialka przez enzymy.
4.3 Fenyloketonuria
- brak enzymiu, ktory rozklada fenylon
* uszkodzenie komorek -> uposledzenie umyslowe
* autosomalne recesywne
- wykrywanie
* badanie moczu u doroslych, rutynowe badania u niemowlat
* leczenie - dieta uboga w fenyloalanina
4.4 Alkaptonuria
- brak rozkladajacego tyrozyne
- odkladanie ciemnych barwnikow w stawach i chrzastkach
- utrudnienie w ruchu
- dieta uboga w tyrozyne
4.5 Tyrozynoza
- Opoznienia rozwoju umyslowego
- Utrata wzroku
4.6 Kretynizm tarczycowy
- brak enzymu tworzacego enzym tarczycowy.
- Niedoczynnosci tarczycy, uposledzenie umyslowe i fizyczne
4.7 Albinizm
- melatonina
4.8 Anemia sierpowata
4.9 Galaktozemia
- defekt w enzymie rozkladajacym galaktoze
- dieta uboga w galaktoze ( a wiec laktoza)
4.10 Cukrzyca dziedziczna
- niedoczynnosc trzustki
4.11 Choroby zwiazane z osrodkowym ukladem nerwowym:
a) Plasawnica Huntingtona
- 30 a 40 rok zycia, zburzenia funkcji ukladu nerwowego, drgawki, otepienie, degeneracja ukladu nerwowego
tay-
b) Choroba Parkinsona
- ujawnienia sie po 40 roku zycia, niedobor dopaminy, powolnosc, drzenie rak, trudnosci z utrz. odpowiedniej postawy ciala
-podawanie prekursorow dopaminy
c) Tay-Sachsa
- recesywana autosomalna, brak enzymu rozkladajacego zbedne lipidy neuronow, uszk. ukl. nerw. slepota
d) Daltonizm
e) Mukowiscytoza
f) Dystorfia miesniowa Dochennna
-sprzezona z plcia, mutacja genu kodujacego najdluzsze bialko miesniowe
4.12 Genomopatie
a) Zespol Kociego Krzyku
- szeroko rozstawione oczy, plaska nasada nosa , mala glowa, nieprawidlowa
b) Zespol Downa
- uposledzenie umsylowe, wady serca, choroby , przedwczesna smierc ok. 40 roku zycia
c) Zespol Edwarda
-trisomia chromosomu 18
-powazna deformacja, polidoksylia, wady serca, smierc w wieku dzieciecym
d) Zespol Turnera
-monosomia, kobieta bezplodna, wady serca
e) Zespol Klinefera
-cialko Barra u mezczyzn
f) Zespol Supermezczyzny
-wysoki wzrost podwyzszony poziom testosteronu i agresji.
5. Imprinting - rodzicielskie pietno genomowe
a)imprinting genowe - eliminacja chromosomow u sciora Coprophila (Helena Crouse 1980) (owady z rzedu Diptera)
A^m A^p X^m X^p X^p - zygota
A^m - materialny
A^p - ojciec
wczesna embriogeneza
A^m A^p X^m X^p - komorka lini plciowa meska i zenska oraz komorka somatyczna zenska
A^m A^p X^m - komorka somatyczna meska
b) Saurami i Solter
-usuwanie przedjdrza i wprowadzenie innego (zarodek genetyczny)
-tryproid zarodka
-mitochondiraia - material nie wplywa
- material matki i ojca nie jest rownomierny. Ktore geny dziedziczone sa po matce , a ktore po ojcu?
- 60 genow u czlowiekach zlokalizowanych na 20 tys genow wystepujacych u czlowieka
- cetyzyna (5-metylo-cytozyna)
- gen -> czesc strukturalna -> zapisana sekwencja zamieniana w bialko
- gen -> czesc reegulatorowa -> zdecyduje o tym czy gen moze wykonac ekspresje
-czesc regulatrowa + polimeraza (synteza mRNA) -> wspomaga przez kompleksy bialka podstawowy kompleks transkrypcyjny
- jesli w czasie promotorowe cytozy nie jest metylowana - kompleks moze sie polaczyc - > transkrypcja
- jesli metylacja przeskadza w przyczepieniu podstawowego kompleksu transkrypcyjny -> wygaszenie ekspresji genu
c) Imprinting
- Imprinting - geny sa odmiennie metylowane u ojca i matki
- uklad hemizygotyczny - wystepuje np u same XY^(-)
Impringing - jest zjawiskiem odwracalnym
- zmiana imprintingu odbywa sie w czasie tworzenia gamet
k. jajowa + plemniki -> przedjadrze zenskie + przedjadrze meskie
zarodek gynogentyczny (tylko material zenski), zarodek zenski (niedorozwoj forfoblasta)
zarodek androgenetyczny , zarodek zazmeski ( niedorozwoj zarodka)
Material nierownocenny -> zaroedek musi rozpoznawac material zenski i meski -> stad pietno
Nakladanie imprtingu
komorki rozmnazanie -> usuniecie imprintingu -> Na poczatku oogenezy wymazanie i nakladanie imprintingu i na poczatku spermatogenezy usuwamy i nakladamy imprting
spermatazy II -> mozna pobrac pobiera sie zarodnikom z imptingiem
Powody istnienia imprintingu:
-zapobieganie partenogenezie
2004 Japonczycy
1 partenogeneza
koagulacja - same myszy
2 geny
Igf2 - gen kodujacy czynniki wzrost (insulina grow factor) - pod kontrola ojcowskiego genu w oocycie matki
H-19 - hamuje za duzy wzrost osobinka pod kontrola int... matczynego
2 oocyty
1 oocyt prawidlowy
+ H-19
- Igf2
1 occyt niedojrzaly
+ H-19 - zmutowany nieprawidlowy
+ Igf2
800 zmanipulowany
1 mysz
Zaburzenia imprintingu
-nowotwory embrionalne
* zasniad groniasty - rozwija sie u zarodka o 2n = 46 -> wszystkie chromosomy od ojca , 2 plemniki -> material genetyczny sie gubi
* potworniak jajnika - 2n=46 -> od matki do oocytu
* zespol Prodera - Willego
** 15 chromosom A
** u ojca
** zaburzeie w centrum wegetacji
** chromosomunipotencjalny ?
** problemy z jedzeniem (nie je -> zoltawy)
** nie dorozwiniecie umyslowe
** 15 Ach delecja 15q 11-13 (q-dlugie ramie)
** oba fragmenty od matki
* Zespol Angelmana (zespol szczesliwej kukielki)
** 15 chromosom A
** zaburzenie w mimice twarzy
** nadpobudliwosc
** niedorozwoj umyslowy
6. Systemy naprawcze mutacji
Namnazanie dna - Replikacje
mutacje punktowe
E. coli
1x10^-9 - czestosc mutacji
-1 nukleaza - raz na 10^9 cykli replikacji
1x10^-4 - bez systemow kkorekcji mutacji naprawcze
7. Replikacja semikonserwatywna
-kazda z podwojne nici (1 stara nic, 1 nowa nic)
Replikazy
-miejsca gdzie dochodzi do replikacji
-liczba ich jest zalezna od wielkosci genu
-E. coli - genom - 1 replikacja, caly gen
-czlowiek 24 tys. replikaz
enzymy helikazy - ciecie wiazan pomiedzy podwojne nici
topoizomerazy - rozkrecanie
przelaczanie bialek SSB (bialko stabilizujace pojedyncze nici -> nie pozwala polaczyc sie spowrote te podwojne nici)
8. Polimerazy DNA u bakterii
I - naprawa DNA i replikacje
II - naprawa DNA
III - replikacja
czasteczka dolacza sie starter + polimerazy DNA III -> dobudowanie 2 nici DNA 5' -> 3'
nic wiodaca - moze byc polimerazy bez...
polimeraza dobieraznie startera
primoson -
starter DNA III buduje fragment oktazy dziury po primerach sa dobrane przez polimerazy DNA I . fragment Okazai lacza sie pierwsza ligaze nic opozniona.
9. Mutageneza
Mutacje spontaniczne -> zachodza samomutacje
systemy naprawcze
- zdolnosc korekcyjna poliimerazy DNA III
- gen mutacji D -> mutowanie -> 1000 x wiekszy sie czestosc mutacji
- gen mutacji D -> podjednostka E - podjednostka korekcyjne
- jesli polimerazy - sa patrzyli wszystko sie zatrzymanie foli cofa sie, zle fragmenty
mutacje mutatorowe
mutacje antymutatorowe - podnosza wydajnosc systemow najmniejszych
poreplikacyjne prze wymiane niero... sprawdzonych zasad
-uklad systemow mutacji h , mutacji U, mutacji S -> kompleksy enzymow
-mutacji H - rozpoznaje wszelkie nierowne sprawdzone zasady
-mutacji U G-A
-mutacji S G-T
wymarzaja cale program zawierajace zle sprawdzone zasady
p.DNA II
ligazy laczy
-G -
-A
Do poprawy moze dojsc do kilku minut po replikacji. Stara nic metylowana na nowa tasma nie jest metylowana.
Zrodla mutacji sammemu mozna znalezc w DNA
demetylacja 5 metylocytozyny - tymina
demtylacja cytozyny - uracyl
Mutacje indukowane i ich demetylacja
Praca H.J. Mullera 1927
Praca Auerbach 1942
260nm
fotodmierny
pofragmentowanie genomu - smiersc komorki
Foto... - usuwanie
-fotoredukcja - enzym fotoliaza energia slonecznej - roz.. dimeru
-UVR A, B, C, D (UV resistsant)
UVR A - rozpoznanie fotodimeru
UVR B i C -> powoduje wymiane fragmentu DNA
UVR D - helikaza - rozlega ...
bialko recA -> przesuwa wyga
struktura Hollidaya
u bakterii znalezione polimeraza DNA tak modyfikowana na wprost fotodimerow wlasne dowolne zasady, gdy poprzednie...
Xeroderma pigmentozum (skora barwnikowa ) -> czerwonka ,
10. Ekspresja genow
Droga jaka czasteczki pokonuja "od genu do bialka" przebiega przez procesy transkrypcji i translacji, ktore w polaczeniu sa okreslane mianem ekspresji genow.
Podczas tanskrypcji zachodzacej w jadrze komorkowym infomracja zawarta w Dna jest przepisywana na RNa. W cytoplazimie zachodzi drugi etap ekspresji genow - translacja, podczas ktorej Rna oddzialuje z wyspecjalizowanymi podjednostkami nazwanymi rybosomami. Rybosomy zdolne sa do odczytywania zapisu nukleotydowego w postaci kodonow, a te z kolei tlumaczone sa na sekwencje aminokwasow w czasteczce bialka.
Zjawisko przeplywu informacji z DNA przez RNA do bialka jest fundamentalnym dogmatem biologii molekularnej.
11. Elektrofloreza
Elektroforeza to zjawisko elektrokinetycznego rozdzialu wykorzystujacce migracje czasteczke naladowanych niezrownowazonym ladunkiem, pod wplywem przylozonego pola elektrycznego. Od ponad szescdziesieciu lat pozostaje najczesciej wykorzystywana metoda w obszarze nauk o zyciu; biochemiii bialek, kwasow nukleinowych , biologii molekularnej, farmakologii, medycyny sadowej, diagnostyce medycznej i kontroli jakosci zywnosci. Technika ta moze byc stosowana d izolacji makromolekul w ukladach biologicznych, ale takze jako narzedzie dostarczajace informacji na temat masy czasteczkowej, modyfikacji struktury, ladunku, czystosci preparatu, wykrywania peptydow, bialek i kwasow nukleinowych.
Przylozenie pola elektrycznego wymusza ruch czasteczek nalozonych na zel, a odleglosc, jaka sa w stanie pokonac zalezy od wielkosci porow ukladu rozdzielajacego, masy czasteczkowej rozdzielanych substancji i ich wypadkowa ladunku. Ruch duzych czasteczek jest spowalnianuy poprzez regulacje wielkosci porow (podobnie jak sito molekularne) i w efekcie sa one zlokalizowane w gornym fragmencie zelu. Tempo migracji czasteczek jest wartoscia stala, ktora zalezy od natezenia pola elektrycznego , rozmiaru i ksztaltu czasteczki, hydrofobosci, sily jonowej , lepkosci i temperatury.
Ruchliwosc elektroforetyczna wyraza sie wzorem:
μ = V/E = z/f
μ - ruchliwosc elektroforetyczna
V - predkosc, z jaka porusza sie czasteczka
E - wartosc natezenia pola elektrycznego
Z - ladunek calkowity czasteczki
f - wspolczynnika tarcia, zalezny od ksztaltu i wielkosci czasteczki
f = 6πηr
η - lepkosc
r - promien czasteczki (wiekszosc czasteczek nie ma ksztaltu kulistego, ale rownanie definiuje wspolczynnik tarcia wyznaczony empirycznie na podstawie ruchliwosci)
Uklad zasilajacy skonstruowany w taki sposob, aby utrzymac stala wartosc jednego z parametrow: natezenia pradu, napiecia lub mocy. W trakcie rozdzialu opornosc elektrolitu ulega zmianom; obniza sie ze wzrostem temperatury, rosnie wraz z ubytkiem jonow oraz ich uporzadkowaniem w ukladzie. Wraz ze wzrostem temperatury wydluza sie czas rozdzialu, a tym samym pojawia sie wzmozona dyfuzja molekul i utrata ich biologicznej aktywnosci , dlatego najnowsze konstrukcje posiadaja system chlodzenia . Elektroforeza bialek prowadzona jest przy stalej wartosci natezenia pradu, a kwasow nukleinowych przy stalym napieciu.
Rozdzial elektroforetyczny jest pracochlonnym krokiem w postepowaniu protemicznym, ktorego nie udalo sie zautomatyzowac.
Zele przygotowane sa z agarozy, dwucukru - agarozbiozy, ktory pozostaje w stanie plynnym powyzej temperatury 40oC, a po ochlodzeniu zestala sie do postaci zelu, ktorego usieciowanie zalezy od stezenia cukru. Powstanie zelu agarozowego jest reakcja odwracalna, w wyniku ktorej pojedyncze, losowo zwiniete lancuchy ukladaja sie w dwuniciowa, helikalna strukture III-rzedowa, ktore rozgaleziajac sie tworzac siec.
Agaroza rozpuszcza sie bardzo latwo w gotujacej sie wodzie i pozostaje w stanie plynnym az do temperatury okolo 40oC. Ponizej tej temperatury zestala sie w postaci porowatego zelu. Po zestaleniu pozostaje w tej postaci nawet w podwyzszonych temperaturach siegajacych kilkudziesieciu oC. Rozmiary porowatosci mozna regulowac stosujac agaroze w roznych stezeniach. Im wyzsze jest stezenie agarozy, tym bogatsze jest usieciowienie i drobniejsze sa pory. Zwykle przygotowuje sie zele o stezeniach agarozy z przedzialu 0,4-4,0%. Zaleta zeli agarozowych jest latwosc i szybkosc ich przygotowania oraz mozliwosc separacji duzych molekul np. DNA i RNA. Wada zas jest slaba wytrzymalosc mechaniczna zeli oraz trudnosc ich utrwalania po rozdziale. Wyschniete zele rozsypuja sie pod wplywem bardzo niewielkich sil. Zel agarozowy stosuje sie do rozdzielenia DNa o szerokim zakresie mas czasteczkowych.
Stezenie agarozy [%] Zakres dlugosci i rozdzielanego liniowego DNA [kp.z]
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
Elektroforeza w zelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdzial elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBEx1 (90mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA , pH 8) lub TAEx1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8). Czasteczka DNA jest naladowana ujemnie w srodowisku obojetnym i alkalicznym, a wiec umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza sie w kierunku anody. DNA o tych samych masach czasteczkowych, ale roznych konformacjach charakteryzuje rozna ruchliwosc elektroforetyczna. Im dluzsza jest czasteczka DNA lub RNA tym dluzej odnajduje ona droge poprzez pory zelu. Jezeli umiescimy DNA w zelu agarozowym i przylozymy niskie napiecie to predkosc migracji DNA o roznych ciezerach czasteczkowych jest proporcjonalna do napiecia.
Zeli poliakrylamidowy jest formowany w wyniku polimeryzacji dwoch toksycznych skladowych: akrylamidu i N, N^1- metylenobisakrylamidu (bisakrylamidu, ktory powoduje sieciowanie ukladu . Polimeralizacja rozpoczyna sie po dodaniu APS (nadsiarczanu amonu) [(NH_4)S_2O_8] w obecnosci katalizatora DMAP (β-dimetyloaminopropionitryl) lub TEMED (N, N, N^1, N^1 -tertametyletylenoamina).
Rozdzial czasteczek jest uwarunkowany wielkoscia porow uformowanych wewnatrz zelu, ktore moga byc modyfikowane przez stosunek ilosci akrylamidu do bisakrylamidu.
%T = (akrylamid + biskrylamid) [g[
%C = (bisakrylamid [g] x 100) / (akrylamid + bisakrylamid)[g]
Wzrost ilosci akrylamidu powoduje zmniejszenie wielkosci porow, natomiast stezenie bisakrylamidu dla najbardziej zwartej sieci wynosi 5% i jakikolwiek wzrost lub spadek jego stezenia powoduje powiekszenie porow zelu.
Zaleznosc akrylamidu od wielkosci rozdzielanych substancji
%C Masa czasteczkowa rozdzielonych substancji [kDa]
7 50-500
10 20-300
12 10-200
15 3-100
Proces polimerzacji zalezy od stezenia zelu oraz obecnosci katalizatora. W temperaturze pokojowej akrylamid polimeryzuje ok. 20-30 minut, natomiast utworzenie kompletnego usieciowania trwa okolo 12 godzin. Nalezy pamietac, ze tlen jest inhibtorem tej reakcji, dlatego powinno sie zabezpieczyc zel przed dostepem powietrza, nawrstwiajac na jego powierzchnie wode badz butanol. Proces polimeralizacji akrylamidu jest reakcja egzotermiczna, a wydzielane cieplo moze spowodowac nieregularnosci w sieciowaniu i porowatosci nosnika, a o za tym idzie pogorszonymi wynikami sparacji ("smiejacy sie" rodzial, dublety prazkow). Dlatego najlepiej ten etap przeprowadzac w lodowce.
Wiekszosc bialek i kwasow nukleinowych jest niewidoczna na zelu w swietle bialym. niezbedna jest wizualizacja pozwalajaca na dalsza analize jakosciowa i ilosciowa. Stosowanych jest wiele technik barwienia, a ich wybor jest bardzo wazny dla dalszych wynikow np.: badan nad zmiana ekspresji. Najczesciej uzywany jest blekit metylenowy lub sole srebrowe. Proces wizualizacji powinien byc szybki, nietoksyczny i tani, a intensywnosc zabarwienia prazka powinna spelniac liniowa zaleznosc od stezenia.
Odczynniki:
-bufor homogenizacyjny 5% NaCl, 20 mM EDTA, 2% SDS
-roztwor trypsyny 1mg/ml
-alkohol 80% EtOH lub izopropoanol
-roztwor 1% agarozy w buforze TAE
-bufor TAE 24,2g Tris, 20 mM EDTA, 5,7 ml CH_3COOH
-bufor do probek 5% glicerol w buforze TAE
-barwnik roztwor blekitu metylenowego, sole srebrowe lub zielen malachitowa
-roztwor enzymu restrykcyjnego
Izolacja materialu genetycznego z komorek cebuli:
Cebule pokroic w bardzo drobna kostke, umiescic w zalewce 50 ml i zalac 5 ml buforu homogenizacyjnego.
Probke inkubowac w temperaturze 60oC na lazni wodnej przez 10 minut.
Mieszaniince homogenizowac przy uzyciu homogenizatora mechanicznego, a nastepnie przesaczyc przez filtr pod obnizonym cisnieniem.
Dodac do probki 50 μl roztworu trypsyny.
Przesacz rozdzielic do 6 probowek, a nastepnie delikatnie po sciance nawarstwiaxc roztwor zmrozonym alkoholem, tak aby utworzyla sie odrebna warstwa.
Po kilku minutach na granicy faz mozna zaobserwowac wytracone nici DNA.
Osad DNA nalezy przeniesc przy uzyciu pipety Pasteura do suchej probowki i przemyc zmrozonym alkoholem.
Odsciagnac roztwor alkoholu i wysuszyc osad przy uzyciu Speedvaca.
Elektrofereza fragmentow DNA
Przygotowac zel agarozowy poprzez ogrzanie 1% roztworu agarozy w buforze TAE w temperaturze 99oC na lazni wodnej przez okolo 15 minut ( do rozpuszczenia agarozy).
Wylac ostudzona do okolo 50oC agaroze do formy i poczekac do zastyganiecia zelu (okolo 10 minut).
Przygotowac probki do rozdzialu na zelu agarozowym:
Probka nr 1: dodac 30 μl buforu do probek i nastepnie wymieszac przy uzyciu Vortexa
Probka nr 2: dodac 5 μl roztworu enzymu restrykcyjnego. Inkubowac 5 minut, a nastepnie dodac 30 μl buforu do probowek i wymieszac przy uzyciu Vortexa.
Naniesc probki na zel w objetosci 20 μl.
Rozdzial elektroforetyczny prowadzic przy stalym natezeniu pradu 60V przez 5 minut, a nastepnie 100V przez 15 minut.
Przygotowac probki do rozdzialu na zelu poliakrylamidowym:
Probka nr 4: dodac 30 μl buforu do probek i nastepnie wymieszac przy uzyciu Vortexa
Probka nr 5: dodac 5 μl roztworu enzymu restrekcyjnego. Inkubowac 5 minut, a nastepnie dodac 30 μl buforu do probowek i wymieszac przy uzyciu Vortexa.
Probka nr 6 : inkubowac probke przez 5 minut na lazni ultradzwiekowej, a nastepnie dodac 30 μl buforu do probek i wymieszac przy uzyciu Vortexa.
Naniesc probki na zel w objetosci 20 μl.
Rozdzial elektroforetyczny prowadzic przy stalym natezeniu pradu 60V przez 5 minut, a nastepnie 100V przez 15 minut.
Barwienie zelu
Zel przeniesc do pojemnika wypelnionego roztworem barwnika i inkubowac 15 minut mieszakac na rotorze .
Zel orzemyc roztworem alkoholu 10% nastepnie woda.
Zaobserwowac roznice w polozeniach prazkow w poszczegolnych studzienkach.
12. Mendel
Dominant
Seed (Round, Yellow, Graycoat (red flower) )
Pods (Inflated Green)
Seed (Wirinkled, Green, Whitecoat (white flower) )
Pods (Pinched Yellow)
Stemps
Axial Flowers, Tall
Terminal Flowers, Short
utrzymujac sie w typie homozygoty
I prawo czystosci gamet
Jednostki dziedziczenie wniesione przez kazdego z rodzicow oddzielaja sie od siebie w czaseie tworzenia gamet przez mieszanie
P: AA x aa
F1: Aa
F2: AA, 2Aa, aa
13. Pojecia
Homozygota - posiada jednakowe allele tego samego genu
Gen - 2 allelow (Allellomorf) - Johansen 1909 (dunczyk)
Fenotyp - calosc informacji genetycznej danego organizmu, cechy, ktore powstaja przy wspoldzialaniu genotypu i srodowiska
Genom jadrowy
Genom mitochondrialny
Genom chloroplastow
Cecha dominujaca - przejawia sie w homo- i heterozygotujaca
Cecha recesywna - przejawia sie w postaci homozygotycznej
Allele - alternatywne formy tego samego genu powstajace w wyniku mutacji zajmujace to samo mutujace lacus (loci) w chromosomach homologicznych
Krzyzowka wsteczna (testowa)
AA x aa -> Aa
Aa x aa -> Aa, aa
Wspoldzialanie alleliczne
-pelna dominacja
-dziedziczenie posrednie - wystepuje wtedy gdy heterozygotyczna, wykazuje w fennotyczne posredni ch...
-wspoldominacja (kodominacja) - oba allele ujawniaja sie w fenatyczne
-overdominacja (naddominacja)
-dehydrogenaza 6-fosforanu
-hemoglobina posrednia - w cisnieniu niskim powstaja krysztaly
H^S - zagesta cytoplazimie
H^AS H^S - zageszczenie cytoplazimie
najlepszea heterozygota w okreslonych warunkach
W^+, W, W^a -> allele wielokrotne, oddnosi sie do populacji
C, c^ch, c^h, c
Pojedyncze geny:
-hydroksylaza fehyloalaninowa
-koenzym tetrahydrobiopteryny
-houskiping genes
-fenyloketonina
-muskowiscytoza
-alkopto...
-albinizm
-Hchondriplazga
-plasawica Huntingtona
-Brachydoktylizm
-Polidaktylizm
Fenylodoza -> kwas fenylopirogronowy
Fenylodoza -> Tyrozyna -> kwas p - hydroksyfenylopirogronowy -(tyronozaonaza) -> kwas homogentyzujacy -(alkoptomina)-> kwas malechoacetooctowy -> dalsze utlenienia
Fenylodoza i kwas fenylopirogronowy - zle dziala na system nerwowy -> uposledzenie
fenyloketonuria 48h - dieta -> gen latwo modyfikowane przez srodowisko, modyfikowane bialka pozbawione feryloalaniny - dieta do dojrzalosci, a jesli kobieta chce miec dziecko - do konca okresu rozrodczego.
Albinizm
- brak zdolnosci wytwarzania barwnika
- do glebszy partii biala moga sie przedstawic promienie UV
Alkaptonuria (czarne pieluchy)
- ciemnienie chrzastek i stawow
-opisana w 1902 przez A. Garrata (Anglik)
Mukowiscydoza
-smiertelna
-mutacja genetyczna bialka budujacego kananl dla jonow chlorkowych
- bardzo slony pot
- niszczenie nablonkow - oddechoweo, pokarmowego, plemnikotworczych - mezczyzni nieplodnii
- umiera sie powiklane drog oddechowych - sluz kwas deoksyrybozami
-uwaza sie ze Chopin zmarl na mukowiscydoze
Dominujace
Aclondrplozja (dlorwizm, karlowatosc) (D)
-glowne Dd , u DD w 20% dziedziczenia, 80% mutacji
-gen bardzo labilny
- wazny wiek ojca
- gen receptora czynnika wzrostu fibroblastow
Plasawica Huntingona
-neurodegeneracja
-taniec swietego Witta
-napady agresji najpierw - nieskorodynowane tanecznemu ruchowi
- ujawnienie sie w pelni ok. 40 roku zycia
Polidaktylia
-dodatkowy kciuk
Brachydaktelia
-skrocenie czlonow palcow
2 prawo mendla
P_0 AABB x aabb
P_1 AaBb
AB Ab aB ab
AB AABB AABb AaBB AaBb
Ab AABb AAbb AaBb Aabb
aB wc wc nc nc
ab wc wB nC nB
9 : 3 : 3 : 1
wc wB nc nB
2 prawo Mendla - cechy dziedzicza sie niezaleznie od siebie jezeli kazda z rozpatrywanych cechy uwarankuwanie jest przez pary alleli, z ktorych jeden byl dom, a drugi recesywny, bo obserwuje sie w pokoleniu F_2 rozszczepienie cech w stosunkach 9:3:3:1
liczba htero.. par alleli n
liczba gamet 2^n
liczba fenotypow w F_2 2^n
liczba genow 3^n
Wspoldzialnie sie alleliczne
a) komplementarne ( dopelniajacej sie)
b) epistatyczne
Plebaltyzm (bielactwo) - geny modyfikatory (geny tla) ( rozna ekspresja genu w zaleznosci od innych)
Dziedziczenie poligemiczne (cechy ilosciow
-sa odpowiedzialne za nie jest wiele genow
-krzywa Gausa (krzywa zmiennosci ciagla)
-allele recesywne dla tych cech sie neutralne, a dominujace
-warunkuja pomieszczenie cechy a jakas jednostke (zwykle ta sama jednostka)
Zjawisko transgresji
-przekroczenie typow rodzicielskich
-im plus lub minus
AaBbCc x AaBbCc C -10g
20g+30g 50g
np.
AABbCc 60 g transgresja im plus
AABbcc 50 g
aaBbcc 30 g transgresja im minus
Cechy ilosciowe - silnie podlegaja wplywa srodowiska
-miesnosc
-jakosc miesa
-niosnosc
Cechy ilosciowe
-inteligencja
-zachowanie
Franus Gatton - jesli bada sie uzaleznienia u czlowieka wieksze sonie ze ludzie uzdolne byci w rodzinie niz to wynika z rachunku prawdopowobienstwa
eugenika - nauka o polepszeniu populacji ludzkiej
-pozytywna lub negatywna
-wynik sterelizacji w wielu krajach
Laura Kaufman (polka) - wplyw srodowiska na genotyp, gen himalaja u krolika - barwa zalezna od temperatury wyluskiwala siersc przylozyla lub powstala barwa czarna
Norma - reakcji genu - zakres w jakim gen moze odpowiedz na modyfikujacy wplyw srodowiska
m. kompensacyjny - we wczesnym okresie rozwoju (marula, plastocysta0 z chromosomem x u samicy losowo ulega inaktywacji
X_ms - gen mozaikowosci- jego mutacja zwiazana jest z zaburzeniami w transporcie miedzi
mutacja leetalna - > choroba menkesa - umieraja glownie chlopcy zyja do 5 roku zycia
Zespol Turnera
-niski wzrost
-lekkie uposledzenie umyslowe -> przejaw rodzicach pietno genomu X od matki o
-platowata szyje
zespol Klinefellera
-mezczyna na 2n autosomach 1 chromosom X
-ma cialko 9-a) forma
-nieplodny - w czasie spermatojowy uaktywnia sie chromosom X
kotki tylko moga byc 3 kolorowe
PAR koniugacje
TDF - > testis deteminy fak.. -> rejony odpowiedzialny ze wytworzenie gamet meskich
czlowiek
koniuguja ze soba X i Y
w czasie gametogenezy niezbendno do prawidlowych konfiguraccyjne niewielkim odcinku PAR - rejon pseudoatosomalny -> odwraca sekwencje homologiczne -> moze tam dochodzic do crossing over
Tdy
xPAR
mysz
U czlowieka glebokie glebokie crossing - ktory poza rejon homologiczny moze sie zdazyc ze TDF przeniesie sie z Y na X.
SRY - sex otelerminig region of the X chromosom
Dawia Page - znakowanie geny na chromosomy Y PP1007
Wyplyw srodowisko wewnetrznego
Penetracja genu - srodowiska zewnetrznego zalezy czy sie gen ujawnic czy nie (pelna czy niepelna penetracja genu) -> odnosi sie do populacji
Ekspresja genu - natezenie cechy - przy mutacji Bar ( redukcja liczby ...) -> w zaleznosci temperatury
Trafill Lysenko - wyplyw srodowiska (kukurydza)
Wazne roztrzygniecie srodowisko-genotyp
-spelnienie
- z punktu jednostki
Inteligencja dziedziczona w 40%
Srodowisko matczyne -> tez ma wplyw
Rozmnazanie plciowe przewaza - mimo ze wydatek energetyczny jest wiekszy
Rekombinacja cech i utrwlenie sie
-mejoza - crosing over
-niezalezna regeneracja chromosomow
-losowe laczenie sie gamet
W bezplciowym - jedynym zrodlem zmiennosci sie mutacji.
Zmiennosc - pozwalaja przystosowac sie do warunkow ...
Rozmnazanie plciowe
I Sygnal wywolawczy
II Kaskada genow regulatorowych
III Geny bezposrednio odpowiedzialne za roznice plciowe
I
Srodowisko
Stosunek X/A ( do zespolu autosomow)
Obecnosc Y
Bihawioralny rozwoj -> ryba w srodowisku -> duno samiec rozmnasia siejako samica i na odwrot
Na poczatku zarodek nie jest zroznicowany plciowo -> sygnal wywolywany -> przestawienie rozwoju na plec nadrzedna
Dropshidia - stosunek X/A
2n != 8
Ab Xy XX
XX/2A = 1
X/2A = 0,5
Y - potrzebny do permatogenezy nie potrzebny do determinowania plci
bezwzgledu na ilosc X na Y
1 przypadek 4-5X i Y - dziewczynka i
Chromosomy determinuja plec u ssakow
X nie jest homologiczny do Y para kilkoma wypadku nie zawiera homohefun... genow.
mechanizm kompensacji - wyrownujacy dysproporcje u zawartosci genow pomiedz samcem i samica
SRy
- konserwatywny - na domenie
- HMG - high mobility group box
-80 aminokwasow
- ma zdolnosc laczenia sie z DNA
- czynnik transkrypcyjny
- ma zdolnosc nagrania czastki DNA
-SRY wygra
14.
100. Literatura
1) W. Gajewski "Genetyka ogolna i molekularna" PWN 1983
2) "Genetyka molekularna" - praca zbiorowa pod redakcja P. Weglenskiego PWN, W-wa 1996r.
3) S. Rogalska , J. Maluszynska, M. Olszewska "Podstawy cytogenetyki rosli" PWn, W-wa 1999
4) K. cliaron, M. Swironski "Genetyka zwierzat" PWN W-wa 2000
5) T.R. Brown "Genomy" PWN W-wa 2001
a) Informacja genetyczna
- przekonowany z pokolenia na pokolenie zapis o jakiejs cesze lub cechach organizmu.
b) historia
- poczatek XX - byly wszystkie podstawowe skladniki organiowane komorki - bialka, lipidy, cukry i kwasy nukleinowe.
-lata 20 XX w. Fredrick Griffith
* przeprowadzil doswiadczenie, dzieki ktoremu w dosc prosty sposob dowrocil przekazywane informacji genetycznej. Wykorzystal 2 szczepy dwoinki zapalenia pluc
** zjadliwy - wywoluje u myszy zapalenia pluc
** maja charakterystyczne "sluzowe" otoczki
* lagodny
** nie wywoluje u myszy zapalenia pluc
** brak otoczki
-Griffith podawal bakterie zjadliwe (z otoczkami) oraz bakterie lagodne (nie majace otoczek). Stwierdzil wowczas miedzy innymi.
1673 - Hde Graaf - podal ze odkryl komorek jajowych ssaka (pecherzyk Grafa
1673 - K. Baer - odkryl wlasciwy oocyt
1673 - A. Leevenhoek - plemnik
1673 - R. runnett
1865 - J. G. Mendel i kolpurskularna teoria dziejow
1900 - C. correns, E. Tschermak, H. de Vries - narodziny genetyki, niezalezne powtorzyc doswiadczenie Mendla
1902 - A. Garrad
1909 - W. Johannsen
Poster obalil teorie samorobctwa
1910-1914 - T. Morgan i inni i katalizacja genow w chromosomie
1944 - O. T. A Very i inni : DNA nosnikiem informacje genetyczny
1953 - J. Watson i F. Crlilk: model budowy DNA
1966 - G. Khorana i inni : odczytanie kodu genetycznego
od 1970 - zastosowanie enzymow restrykcyjnych do ciecia DNA
1975 - konferencja w Asilomor (USA) na temat manipulacji genetycznych , tak manipulowac by nie mogly przezyc na wolnosci
1980 - pierwsze zwierzeta transgeniczne
1997 - pierwszy sklonowany ssak (Dolly)
1998 - pierwszy w calosci zmapowany chromosom czlowieka (22)
2000 - zskwencjonowany genom czlowieka
2. Inzynieria genetyczna - narzedzia i metody
2.1 Specjalne nukleazy bronia komorke bakterii przed atakiem fagow.
Enzymy niszczace czasteczki kwasow nukleinowych nazywamy ogolnie nukleazami. U bakterii wystepuja specjalne nukleazy, ktore niszcza w komorce obce czasteczki DNA.
Genom bakteryjn jest zabezpieczony przed dzialaniem takich enzymow poprzez swoista modyfikacje Dna: do pierscienia niektorych aadenin i cytozyn jest przyloczona dodatkowa grupa metylowa (-CH_3). Modyfikacja taka, zwana metylacja DNA, zabezpiecza chromosom bakteryjny przed dzialaniem nukleaz wystepujacych w komorce.
Zasadnicza rola enzymow niszczacych obcy DNA jest ochrona bakterii przed atakiem bakteriofagow, czyli wirusow komorek bakteryjnych, zwanych inaczej fagami. Jezeli fagi zdolaly zainfekowac katerie i wprowadzily do jej wnetrza swoj material genetyczny, zostanie on blyskawicznie rozpoznany i skutecznie zniszczony przez odpowiednie enzymy. Komorka moze wtedy dalej zyc i dzielic sie. Jezeli system zawiedzie, zainfekowana bakteria stanie sie "inkubatorem" nowych bakteriofagow, wczesniej lub pozniej zostanie przez nie zniszczona i uwolni tysiace nowych czastek fagowych.
Specjalne nukleazy, ktore walcza w komorkach bakterii z DNA bakteriofagow nazywano enzymami restrykcyjnymi (restryktazami).
2.2 Restryktazy rozcinaja DNA w scisle okreslonych miejscach.
Na poczatkach lat siedemdziesiatych udalo sie wyizolowac z komorek bakterii pierwsze enzymy restrykcyjne. dokladne badania laboratoryjne wykazaly, ze sa one nizwykle precyzyjne w swoim dzialaniu. Kazda z restryktaz rozpoznaje okreslona, krotka sekwencje nukleotydowa, przylacza sie do niej , a nastepnie rozcina czasteczek DNA tylko w odrebie rozpoznanej sekwencji. jezeli miejsc takich jest kilka , to enzym tnie czasteczke DNa tylko w obrebie rozpoznanej sekwencji. Jezeli miejsc takich jest kilka, to enzym tnie czasteczke DNa na odpowiednia liczbe mniejszych fragmentow. Wiekszosc enzymow restrykcyjnych rozpoznaje cztero- lub szescionukleotydowe sekwencje palindromowe; niektore z nich rozpoznaja dluzsze sekwencje. Na pewno wiecie, ze palindromy to lowa lub zdania , ktore czytane od poczatku do konca oraz wspak maja identyczne znaczenie (na przyklad KAJAK lub zdanie KOBYLA MA MALY BOK). sekwencja palindromowa w przypadku DNA ma identyczna kolejnosc zasad na jedenj i na drugiej nici, na przyklad
5' - AACGTT - 3'
3' - TTGCAA - 5'
Jezeli przeczytacie kazda z nic tej czasteczki w kierunku 5' -> 3', to otrzymacie w obu przypadkach identyczna sekwencje. AACGTT.
Niektore restryktazy rozcinaja obie nici DNA symetrycznie, a niektore nacinaja jedna nic czasteczki w jednym miejscu, a druga kilka nukleotydow dalej. W wyniku takiego asymetrycznego rozciecia czasteczki DNA produkty reakcji maja wystajace, jednoniciowe odcinki. Konce z takimi jednoniciowymi fragmentami nazywamy lepkimi, natomiast powstale w wyniku rozciecia symetrycznego nazywamy tepymi.
Przyklady sekwencji nukleotydowych rozpoznawanych i przecinanych przez enzymy restrykcyjne
a) lepkie konce
5' ... GAATTC ... 3' 5' ... G AATTC ... 3'
- restryktaza EcoRI ->
3' ... CTTAAG ... 5' 3' ... CTTAA G ... 5'
b) tepe konce
5' ... GTTAAC ... 3' 5' ... GTT AAC ... 3'
- restryktaza HhaI ->
3' ... CAATTG ... 5' 3' ... CAA TTG ... 5'
Poszczegolnym enzymom restrykcyjnym nadawano nazwy nawiazujace do szczepow bakteryjnych , z kyotych je wyizolowano. Poniewaz z jednego szczepu bakteryjnego izolowano kilka restryktaz, kazda nastepna oznaczano kolejnym numerem ( na przyklad enzym EcoRI to pierwszy enzym wyizolowany ze szczepu R paleczki okreznicy E. coli , a HindIII to trzecia resryktaza wyizolowana ze szczepu d bakterii Haemophilus influenzae).
Wszystkie enzymy restrykcyjne maja trzy przydatne wlasciwosci. Po pierwsze , dzialaja in vitro, czyli poza komorka bakteryjna (w probowce). Po drugie, rozpoznaja z taka sama precyzja czasteczki DNA wyizolowane z bakteriofaga, czlowieka lub pszenicy. I wreszccie po trzecie, dzialaja powtarzalnie, czyli konkretny enzym rozcina zawsze czasteczke DNA tylko w jednen charakterystyczny sposob (liczba rozciec zalezy od jej sekwencji). To wlasnie te trzy cechy restryktaz spowodowaly , ze staly sie one podstawowym narzedziem biologii molekuralnej. Pozwolily bowiem na swobodna manipulacje materialem genetycznym pochodzacym z roznych organizmow, czyli na dzialania, ktore dzisiaj nazywamy inzynierie genetyczna.
2.3 Elektroforeza zelowa pozwala na rozdzial fragmentow Dna za wzgledu na ich wielkosc.
Po rozcieciu dlugich czasteczek DNA na mniejsze, otrzymane fragmenty nalezy rozdzielic, aby wybrac fragment, ktory zamierzamy poddac dokladnym badaniom. Zwykle wykorzystuje sie do tego celu elektroforeze zelowa. Elektroforeza to rozdzial bialek DNA, RNA lub innych czasteczek za pomoca pola elektrycznego. Elektroforeza, ktora tam opisalismy, prowadzona byla w ultracienkiej rurce - kapilarze. Teraz zajmiemy sie elektroforeza prowadzona w plytce zelowej. Plytka taka przypomina zastygla owocowa galaretka, wylana do plaskiego, prostokatnego pudelka. Po wyjeciu galertki otrzymujemy "plaster" grubosci 0,5-1 cm, ktory do zludzenia przypomina zel uzywany w laboratorium do rozdzialu fragmentow DNA . Galaretka jest zlozona z agarozy. Jeszcze przed zastygnieciem agarozy wklada sie do niej dodatkowa forme (tak zwany grzebien), ktora pozniej, po usunieciu pozostawi na powierzchni zelu charakterystyczne zaglabienie - studzienki . Przygotowany w ten sposob zel jest umieszczany w naczyniu elektroforetycznym, wypelnionym odpowiednim buforem. Bufor - roztwor slabych kwasow i ich soli z mocnymi zasadami lub slabych zasadach i ich soli z niemocnymi kwasami, utrzymujac stala kwasowosc lub zasadowsc osrodka. Mieszanine fragmentow DNA wklada sie do studzienki w plytce zelu. Po obu stronach naczynia elektroforetycznego umieszcza sie elektrody podlaczone do zrodla pradu stalego. Poniewaz czasteczki DNA znajdujace sie w roztworze o pH 8-9 maja ladunkek ujemny (zze wzgledu na obecnosc grup fosforanowych, od ktorych oddysocjowuja protony), pod wplywem napiecia poruszaja sie w kierunku od biegu na ujemnego do dodatniego. Podczas migracji rozdzielaja sie ze wzgledu na zroznicowana dlugosc: mniejsze fragmenty z latwoscia przechodza przez kanaliki w zelu i migruja znacznie szybciej , natomiast wieksze przyciskaja sie przez nie z trudem, dlatego ich wedrowka trwa o wiele duzej. Po zakonczonej elektroforezie zel z rodzielonymi fragmentami traktowany jest odpowiednim barwnikiem i obserwowany w swietle UV. Barwnik przedostaje sie sie miedzy zasady DNA i pod wplywem promieniowania UV emituje swiatlo widzialne. Poszczegolne fragmenty DNA sa widoczne w zelu w postaci wyraznych , "swiecacych" prazkow . Kazdy prazek stanowi kolekcje odcinkow DNA o identycznej dlugosci. Jezeli chcielibysmy wyizolowac ktorys z nich, wystarczy wyciac skalpelem lub zyletka odpowiednik kawalek zelu i wyizolowac z niego interesujacy nas fragment.
2.4 Fragmenty DNA wprowadza sie do czasteczek zwanych wektorami.
Fragmenty DNA izolujemy najczesciej po to, aby wlaczyc je do specjalnej czasteczki DNA, ktora nazywamy wektorem. Wektory sa czasteczkami DNA , ktore pozwalaja na wprowazenie okreslonego frgamentu DNa do wnetrza komorki, najczesciej bakteryjnej, ale takze do komorki drozdzy, ludzkiej lub roslinnej. Oczywiscie, w kazdym z wymienionych przypadkow bedziemy musieli zastosowac inny wektor.
Wektory sa najczesciej plazmidy, czyli male koliste czasteczki Dna wystepujace u bakterii. Jak wiecie, plazmidy wystepuja w komorce w wielu kopiach (powielaja sie niezaleznie od chromosomu bakteryjnego). Maja one miejsce ori, czyli rejon umozliwiajacy rozpoczecie replikacji DnA, oraz gen opornosci na okreslony antybiotyk, nazywany genem markerowym. Komorki bakterii, ktora ma plazmid z takim genem, jest oporna na dzialanie antybiotyku, poniewaz produkt genu markerowego rozklada go lub tez w inny sposob uniemozliwia jego szkodliwe dzialanie.
Pomyslcie tylko, jezeli do plazmidu zostalby wprowadzony dodatkowy fragment DNA, to w komorkach bakterii bedzie on replikowany wraz z czasteczka plazmidowa. Kazda kopia zmodyfikowanego plazmidu bedzie zawierala zintegrowany z nim odcinek obcego DNA.
Poniewaz plazmid jest czasteczka kolista, przed wprowadzeniem do niego fragmentu DNa nalezy go odpowiednio przygotowac. Przede wszystkim trzeba znalezc restryktaze, ktora rozetnie czasteczke wektora tylko w jednym miejscu, tworzac z kolistego plazmidu czasteczke liniowa. Wazne jest rozniez, aby konce rozcietej czasteczki wektroa byly podobne do koncow wlaczanego fragmentu DNA. Jezeli obie czasteczki, ktore maja byc polaczone, bede mialy tepe konce, polacza sie ,nienaleznie od tego, jaki enzym je pozostawil (na przyklad wektor moze byc rozciety enzymem Kpn1, a fragment DNA - EcoRV; oba enzymy po rozcieiciu czasteczkiDNA pozostawiaja tepe konce). Jesli jednak chcemy zastosowac enzym, ktory po cieciu tworzy tak zwane lepkie konce, to nalezy pamietac, ze obie czasteczki musze byc przeciete tym samym enzymem (na przyklad EcoR1). Tylko wtedy wystajace, jednoniciowe odcinki wektora odnajda komplementarna sekwencje na koncach fragmentu DNa.
Enzymem, ktory laczy czasteczke wektora z odpowiednim fragmentem, jest ligaza DNA . Dzieki ligazie obie czasteczki DNA . Otrzymany plazmid jest nazywany plazmidem zrekombinowanym, poniewaz zawiera dodatkowy odcinek DNA. Laczenie z soba roznych czasteczek DNA nazywamy rekombinacja in vitro.
2.5 Zrekombinowane plazmidy wprowadza sie do komorek bakeryjnych
Plazmidy
2.6 Bibliotek genomowa to kolekcja zrekombinowanych wektorow, ktora zawiera wszystkie fragmenty genomu.
2.7 Hybrydyzacja to utworzenie wiazan wodorowych miedzy nicmi DNA o komplementarnej sekwencji.
2.8 Techniki hybrydyzacyjne pozwalaja zidentyfikowac fragment DNa o okreslonej sekwencji.
3. Zastoswoanie inzynierii genetycznej
3.1 Insulina jest hormonem peptydowym syntetyzowanym przez wyspecjalizowane komorki trzustki.
3.2 Poziom glukozy we krwi jest precyzyjnie kontrolowany przez antagonistyczne dzialanie insuliny i glukagonu.
3.3 Najczesciej wystepujacym efektem zaburzen w czynnosci hormonow trzustki jest cukrzyca.
3.4 Insulina jest syntetyzowana w postaci czasteczki prekursorowej.
3.5 Insulina jes t syntetyzowana w postaci prekursorowej.
3.6 Wieloletnie stosowanie insuliny zwierzecej moze byc dla pacjenta niebezpieczne
3.7 Wektory ekspresyjne zawieraja promotory i terminatory transkrypcji.
3.8 Ludzka insulina moze byc produkowana w komorkach bakterii.
3.9 Enzym odwrotna transkryptaza potrafi przepisac mRNA na DNA.
3.10 Produkowane w komorkach prokariotycznych bialka eukariotyczne czesto nie moga przyjac prawidlowej struktury drugo- i trzeciorzedowej.
3.11 Insuline produkuje sie takze w komorkach drozdzy piekarniczych Saccharomyces cerevisiae.
3.12 Produkcja insuliny w komorkach ssakow jest zbyt droga.
3.13 W bakteriach mozna rowniez wyprudukowac somatropine
4. Choroby genetyczne
4.1
a) Genopatie
- anomalie wynikajace z dziedziczeniach pojedynczych zmutowanych alleli
b) Genomopatie
- mutacje w obrebie genomu
c) Mitochondrialne ( w mitochondrium)
4.2
- Choroby zwiazane z zaburzeniami enzymow aromatycznych m. in. egzogenne - w nadmiarze nalezy je rozlozyc. Blok metabolicznych powstaje w momencie niemozliwosci rozkladania bialka przez enzymy.
4.3 Fenyloketonuria
- brak enzymiu, ktory rozklada fenylon
* uszkodzenie komorek -> uposledzenie umyslowe
* autosomalne recesywne
- wykrywanie
* badanie moczu u doroslych, rutynowe badania u niemowlat
* leczenie - dieta uboga w fenyloalanina
4.4 Alkaptonuria
- brak rozkladajacego tyrozyne
- odkladanie ciemnych barwnikow w stawach i chrzastkach
- utrudnienie w ruchu
- dieta uboga w tyrozyne
4.5 Tyrozynoza
- Opoznienia rozwoju umyslowego
- Utrata wzroku
4.6 Kretynizm tarczycowy
- brak enzymu tworzacego enzym tarczycowy.
- Niedoczynnosci tarczycy, uposledzenie umyslowe i fizyczne
4.7 Albinizm
- melatonina
4.8 Anemia sierpowata
4.9 Galaktozemia
- defekt w enzymie rozkladajacym galaktoze
- dieta uboga w galaktoze ( a wiec laktoza)
4.10 Cukrzyca dziedziczna
- niedoczynnosc trzustki
4.11 Choroby zwiazane z osrodkowym ukladem nerwowym:
a) Plasawnica Huntingtona
- 30 a 40 rok zycia, zburzenia funkcji ukladu nerwowego, drgawki, otepienie, degeneracja ukladu nerwowego
tay-
b) Choroba Parkinsona
- ujawnienia sie po 40 roku zycia, niedobor dopaminy, powolnosc, drzenie rak, trudnosci z utrz. odpowiedniej postawy ciala
-podawanie prekursorow dopaminy
c) Tay-Sachsa
- recesywana autosomalna, brak enzymu rozkladajacego zbedne lipidy neuronow, uszk. ukl. nerw. slepota
d) Daltonizm
e) Mukowiscytoza
f) Dystorfia miesniowa Dochennna
-sprzezona z plcia, mutacja genu kodujacego najdluzsze bialko miesniowe
4.12 Genomopatie
a) Zespol Kociego Krzyku
- szeroko rozstawione oczy, plaska nasada nosa , mala glowa, nieprawidlowa
b) Zespol Downa
- uposledzenie umsylowe, wady serca, choroby , przedwczesna smierc ok. 40 roku zycia
c) Zespol Edwarda
-trisomia chromosomu 18
-powazna deformacja, polidoksylia, wady serca, smierc w wieku dzieciecym
d) Zespol Turnera
-monosomia, kobieta bezplodna, wady serca
e) Zespol Klinefera
-cialko Barra u mezczyzn
f) Zespol Supermezczyzny
-wysoki wzrost podwyzszony poziom testosteronu i agresji.
5. Imprinting - rodzicielskie pietno genomowe
a)imprinting genowe - eliminacja chromosomow u sciora Coprophila (Helena Crouse 1980) (owady z rzedu Diptera)
A^m A^p X^m X^p X^p - zygota
A^m - materialny
A^p - ojciec
wczesna embriogeneza
A^m A^p X^m X^p - komorka lini plciowa meska i zenska oraz komorka somatyczna zenska
A^m A^p X^m - komorka somatyczna meska
b) Saurami i Solter
-usuwanie przedjdrza i wprowadzenie innego (zarodek genetyczny)
-tryproid zarodka
-mitochondiraia - material nie wplywa
- material matki i ojca nie jest rownomierny. Ktore geny dziedziczone sa po matce , a ktore po ojcu?
- 60 genow u czlowiekach zlokalizowanych na 20 tys genow wystepujacych u czlowieka
- cetyzyna (5-metylo-cytozyna)
- gen -> czesc strukturalna -> zapisana sekwencja zamieniana w bialko
- gen -> czesc reegulatorowa -> zdecyduje o tym czy gen moze wykonac ekspresje
-czesc regulatrowa + polimeraza (synteza mRNA) -> wspomaga przez kompleksy bialka podstawowy kompleks transkrypcyjny
- jesli w czasie promotorowe cytozy nie jest metylowana - kompleks moze sie polaczyc - > transkrypcja
- jesli metylacja przeskadza w przyczepieniu podstawowego kompleksu transkrypcyjny -> wygaszenie ekspresji genu
c) Imprinting
- Imprinting - geny sa odmiennie metylowane u ojca i matki
- uklad hemizygotyczny - wystepuje np u same XY^(-)
Impringing - jest zjawiskiem odwracalnym
- zmiana imprintingu odbywa sie w czasie tworzenia gamet
k. jajowa + plemniki -> przedjadrze zenskie + przedjadrze meskie
zarodek gynogentyczny (tylko material zenski), zarodek zenski (niedorozwoj forfoblasta)
zarodek androgenetyczny , zarodek zazmeski ( niedorozwoj zarodka)
Material nierownocenny -> zaroedek musi rozpoznawac material zenski i meski -> stad pietno
Nakladanie imprtingu
komorki rozmnazanie -> usuniecie imprintingu -> Na poczatku oogenezy wymazanie i nakladanie imprintingu i na poczatku spermatogenezy usuwamy i nakladamy imprting
spermatazy II -> mozna pobrac pobiera sie zarodnikom z imptingiem
Powody istnienia imprintingu:
-zapobieganie partenogenezie
2004 Japonczycy
1 partenogeneza
koagulacja - same myszy
2 geny
Igf2 - gen kodujacy czynniki wzrost (insulina grow factor) - pod kontrola ojcowskiego genu w oocycie matki
H-19 - hamuje za duzy wzrost osobinka pod kontrola int... matczynego
2 oocyty
1 oocyt prawidlowy
+ H-19
- Igf2
1 occyt niedojrzaly
+ H-19 - zmutowany nieprawidlowy
+ Igf2
800 zmanipulowany
1 mysz
Zaburzenia imprintingu
-nowotwory embrionalne
* zasniad groniasty - rozwija sie u zarodka o 2n = 46 -> wszystkie chromosomy od ojca , 2 plemniki -> material genetyczny sie gubi
* potworniak jajnika - 2n=46 -> od matki do oocytu
* zespol Prodera - Willego
** 15 chromosom A
** u ojca
** zaburzeie w centrum wegetacji
** chromosomunipotencjalny ?
** problemy z jedzeniem (nie je -> zoltawy)
** nie dorozwiniecie umyslowe
** 15 Ach delecja 15q 11-13 (q-dlugie ramie)
** oba fragmenty od matki
* Zespol Angelmana (zespol szczesliwej kukielki)
** 15 chromosom A
** zaburzenie w mimice twarzy
** nadpobudliwosc
** niedorozwoj umyslowy
6. Systemy naprawcze mutacji
Namnazanie dna - Replikacje
mutacje punktowe
E. coli
1x10^-9 - czestosc mutacji
-1 nukleaza - raz na 10^9 cykli replikacji
1x10^-4 - bez systemow kkorekcji mutacji naprawcze
7. Replikacja semikonserwatywna
-kazda z podwojne nici (1 stara nic, 1 nowa nic)
Replikazy
-miejsca gdzie dochodzi do replikacji
-liczba ich jest zalezna od wielkosci genu
-E. coli - genom - 1 replikacja, caly gen
-czlowiek 24 tys. replikaz
enzymy helikazy - ciecie wiazan pomiedzy podwojne nici
topoizomerazy - rozkrecanie
przelaczanie bialek SSB (bialko stabilizujace pojedyncze nici -> nie pozwala polaczyc sie spowrote te podwojne nici)
8. Polimerazy DNA u bakterii
I - naprawa DNA i replikacje
II - naprawa DNA
III - replikacja
czasteczka dolacza sie starter + polimerazy DNA III -> dobudowanie 2 nici DNA 5' -> 3'
nic wiodaca - moze byc polimerazy bez...
polimeraza dobieraznie startera
primoson -
starter DNA III buduje fragment oktazy dziury po primerach sa dobrane przez polimerazy DNA I . fragment Okazai lacza sie pierwsza ligaze nic opozniona.
9. Mutageneza
Mutacje spontaniczne -> zachodza samomutacje
systemy naprawcze
- zdolnosc korekcyjna poliimerazy DNA III
- gen mutacji D -> mutowanie -> 1000 x wiekszy sie czestosc mutacji
- gen mutacji D -> podjednostka E - podjednostka korekcyjne
- jesli polimerazy - sa patrzyli wszystko sie zatrzymanie foli cofa sie, zle fragmenty
mutacje mutatorowe
mutacje antymutatorowe - podnosza wydajnosc systemow najmniejszych
poreplikacyjne prze wymiane niero... sprawdzonych zasad
-uklad systemow mutacji h , mutacji U, mutacji S -> kompleksy enzymow
-mutacji H - rozpoznaje wszelkie nierowne sprawdzone zasady
-mutacji U G-A
-mutacji S G-T
wymarzaja cale program zawierajace zle sprawdzone zasady
p.DNA II
ligazy laczy
-G -
-A
Do poprawy moze dojsc do kilku minut po replikacji. Stara nic metylowana na nowa tasma nie jest metylowana.
Zrodla mutacji sammemu mozna znalezc w DNA
demetylacja 5 metylocytozyny - tymina
demtylacja cytozyny - uracyl
Mutacje indukowane i ich demetylacja
Praca H.J. Mullera 1927
Praca Auerbach 1942
260nm
fotodmierny
pofragmentowanie genomu - smiersc komorki
Foto... - usuwanie
-fotoredukcja - enzym fotoliaza energia slonecznej - roz.. dimeru
-UVR A, B, C, D (UV resistsant)
UVR A - rozpoznanie fotodimeru
UVR B i C -> powoduje wymiane fragmentu DNA
UVR D - helikaza - rozlega ...
bialko recA -> przesuwa wyga
struktura Hollidaya
u bakterii znalezione polimeraza DNA tak modyfikowana na wprost fotodimerow wlasne dowolne zasady, gdy poprzednie...
Xeroderma pigmentozum (skora barwnikowa ) -> czerwonka ,
10. Ekspresja genow
Droga jaka czasteczki pokonuja "od genu do bialka" przebiega przez procesy transkrypcji i translacji, ktore w polaczeniu sa okreslane mianem ekspresji genow.
Podczas tanskrypcji zachodzacej w jadrze komorkowym infomracja zawarta w Dna jest przepisywana na RNa. W cytoplazimie zachodzi drugi etap ekspresji genow - translacja, podczas ktorej Rna oddzialuje z wyspecjalizowanymi podjednostkami nazwanymi rybosomami. Rybosomy zdolne sa do odczytywania zapisu nukleotydowego w postaci kodonow, a te z kolei tlumaczone sa na sekwencje aminokwasow w czasteczce bialka.
Zjawisko przeplywu informacji z DNA przez RNA do bialka jest fundamentalnym dogmatem biologii molekularnej.
11. Elektrofloreza
Elektroforeza to zjawisko elektrokinetycznego rozdzialu wykorzystujacce migracje czasteczke naladowanych niezrownowazonym ladunkiem, pod wplywem przylozonego pola elektrycznego. Od ponad szescdziesieciu lat pozostaje najczesciej wykorzystywana metoda w obszarze nauk o zyciu; biochemiii bialek, kwasow nukleinowych , biologii molekularnej, farmakologii, medycyny sadowej, diagnostyce medycznej i kontroli jakosci zywnosci. Technika ta moze byc stosowana d izolacji makromolekul w ukladach biologicznych, ale takze jako narzedzie dostarczajace informacji na temat masy czasteczkowej, modyfikacji struktury, ladunku, czystosci preparatu, wykrywania peptydow, bialek i kwasow nukleinowych.
Przylozenie pola elektrycznego wymusza ruch czasteczek nalozonych na zel, a odleglosc, jaka sa w stanie pokonac zalezy od wielkosci porow ukladu rozdzielajacego, masy czasteczkowej rozdzielanych substancji i ich wypadkowa ladunku. Ruch duzych czasteczek jest spowalnianuy poprzez regulacje wielkosci porow (podobnie jak sito molekularne) i w efekcie sa one zlokalizowane w gornym fragmencie zelu. Tempo migracji czasteczek jest wartoscia stala, ktora zalezy od natezenia pola elektrycznego , rozmiaru i ksztaltu czasteczki, hydrofobosci, sily jonowej , lepkosci i temperatury.
Ruchliwosc elektroforetyczna wyraza sie wzorem:
μ = V/E = z/f
μ - ruchliwosc elektroforetyczna
V - predkosc, z jaka porusza sie czasteczka
E - wartosc natezenia pola elektrycznego
Z - ladunek calkowity czasteczki
f - wspolczynnika tarcia, zalezny od ksztaltu i wielkosci czasteczki
f = 6πηr
η - lepkosc
r - promien czasteczki (wiekszosc czasteczek nie ma ksztaltu kulistego, ale rownanie definiuje wspolczynnik tarcia wyznaczony empirycznie na podstawie ruchliwosci)
Uklad zasilajacy skonstruowany w taki sposob, aby utrzymac stala wartosc jednego z parametrow: natezenia pradu, napiecia lub mocy. W trakcie rozdzialu opornosc elektrolitu ulega zmianom; obniza sie ze wzrostem temperatury, rosnie wraz z ubytkiem jonow oraz ich uporzadkowaniem w ukladzie. Wraz ze wzrostem temperatury wydluza sie czas rozdzialu, a tym samym pojawia sie wzmozona dyfuzja molekul i utrata ich biologicznej aktywnosci , dlatego najnowsze konstrukcje posiadaja system chlodzenia . Elektroforeza bialek prowadzona jest przy stalej wartosci natezenia pradu, a kwasow nukleinowych przy stalym napieciu.
Rozdzial elektroforetyczny jest pracochlonnym krokiem w postepowaniu protemicznym, ktorego nie udalo sie zautomatyzowac.
Zele przygotowane sa z agarozy, dwucukru - agarozbiozy, ktory pozostaje w stanie plynnym powyzej temperatury 40oC, a po ochlodzeniu zestala sie do postaci zelu, ktorego usieciowanie zalezy od stezenia cukru. Powstanie zelu agarozowego jest reakcja odwracalna, w wyniku ktorej pojedyncze, losowo zwiniete lancuchy ukladaja sie w dwuniciowa, helikalna strukture III-rzedowa, ktore rozgaleziajac sie tworzac siec.
Agaroza rozpuszcza sie bardzo latwo w gotujacej sie wodzie i pozostaje w stanie plynnym az do temperatury okolo 40oC. Ponizej tej temperatury zestala sie w postaci porowatego zelu. Po zestaleniu pozostaje w tej postaci nawet w podwyzszonych temperaturach siegajacych kilkudziesieciu oC. Rozmiary porowatosci mozna regulowac stosujac agaroze w roznych stezeniach. Im wyzsze jest stezenie agarozy, tym bogatsze jest usieciowienie i drobniejsze sa pory. Zwykle przygotowuje sie zele o stezeniach agarozy z przedzialu 0,4-4,0%. Zaleta zeli agarozowych jest latwosc i szybkosc ich przygotowania oraz mozliwosc separacji duzych molekul np. DNA i RNA. Wada zas jest slaba wytrzymalosc mechaniczna zeli oraz trudnosc ich utrwalania po rozdziale. Wyschniete zele rozsypuja sie pod wplywem bardzo niewielkich sil. Zel agarozowy stosuje sie do rozdzielenia DNa o szerokim zakresie mas czasteczkowych.
Stezenie agarozy [%] Zakres dlugosci i rozdzielanego liniowego DNA [kp.z]
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
Elektroforeza w zelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdzial elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBEx1 (90mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA , pH 8) lub TAEx1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8). Czasteczka DNA jest naladowana ujemnie w srodowisku obojetnym i alkalicznym, a wiec umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza sie w kierunku anody. DNA o tych samych masach czasteczkowych, ale roznych konformacjach charakteryzuje rozna ruchliwosc elektroforetyczna. Im dluzsza jest czasteczka DNA lub RNA tym dluzej odnajduje ona droge poprzez pory zelu. Jezeli umiescimy DNA w zelu agarozowym i przylozymy niskie napiecie to predkosc migracji DNA o roznych ciezerach czasteczkowych jest proporcjonalna do napiecia.
Zeli poliakrylamidowy jest formowany w wyniku polimeryzacji dwoch toksycznych skladowych: akrylamidu i N, N^1- metylenobisakrylamidu (bisakrylamidu, ktory powoduje sieciowanie ukladu . Polimeralizacja rozpoczyna sie po dodaniu APS (nadsiarczanu amonu) [(NH_4)S_2O_8] w obecnosci katalizatora DMAP (β-dimetyloaminopropionitryl) lub TEMED (N, N, N^1, N^1 -tertametyletylenoamina).
Rozdzial czasteczek jest uwarunkowany wielkoscia porow uformowanych wewnatrz zelu, ktore moga byc modyfikowane przez stosunek ilosci akrylamidu do bisakrylamidu.
%T = (akrylamid + biskrylamid) [g[
%C = (bisakrylamid [g] x 100) / (akrylamid + bisakrylamid)[g]
Wzrost ilosci akrylamidu powoduje zmniejszenie wielkosci porow, natomiast stezenie bisakrylamidu dla najbardziej zwartej sieci wynosi 5% i jakikolwiek wzrost lub spadek jego stezenia powoduje powiekszenie porow zelu.
Zaleznosc akrylamidu od wielkosci rozdzielanych substancji
%C Masa czasteczkowa rozdzielonych substancji [kDa]
7 50-500
10 20-300
12 10-200
15 3-100
Proces polimerzacji zalezy od stezenia zelu oraz obecnosci katalizatora. W temperaturze pokojowej akrylamid polimeryzuje ok. 20-30 minut, natomiast utworzenie kompletnego usieciowania trwa okolo 12 godzin. Nalezy pamietac, ze tlen jest inhibtorem tej reakcji, dlatego powinno sie zabezpieczyc zel przed dostepem powietrza, nawrstwiajac na jego powierzchnie wode badz butanol. Proces polimeralizacji akrylamidu jest reakcja egzotermiczna, a wydzielane cieplo moze spowodowac nieregularnosci w sieciowaniu i porowatosci nosnika, a o za tym idzie pogorszonymi wynikami sparacji ("smiejacy sie" rodzial, dublety prazkow). Dlatego najlepiej ten etap przeprowadzac w lodowce.
Wiekszosc bialek i kwasow nukleinowych jest niewidoczna na zelu w swietle bialym. niezbedna jest wizualizacja pozwalajaca na dalsza analize jakosciowa i ilosciowa. Stosowanych jest wiele technik barwienia, a ich wybor jest bardzo wazny dla dalszych wynikow np.: badan nad zmiana ekspresji. Najczesciej uzywany jest blekit metylenowy lub sole srebrowe. Proces wizualizacji powinien byc szybki, nietoksyczny i tani, a intensywnosc zabarwienia prazka powinna spelniac liniowa zaleznosc od stezenia.
Odczynniki:
-bufor homogenizacyjny 5% NaCl, 20 mM EDTA, 2% SDS
-roztwor trypsyny 1mg/ml
-alkohol 80% EtOH lub izopropoanol
-roztwor 1% agarozy w buforze TAE
-bufor TAE 24,2g Tris, 20 mM EDTA, 5,7 ml CH_3COOH
-bufor do probek 5% glicerol w buforze TAE
-barwnik roztwor blekitu metylenowego, sole srebrowe lub zielen malachitowa
-roztwor enzymu restrykcyjnego
Izolacja materialu genetycznego z komorek cebuli:
Cebule pokroic w bardzo drobna kostke, umiescic w zalewce 50 ml i zalac 5 ml buforu homogenizacyjnego.
Probke inkubowac w temperaturze 60oC na lazni wodnej przez 10 minut.
Mieszaniince homogenizowac przy uzyciu homogenizatora mechanicznego, a nastepnie przesaczyc przez filtr pod obnizonym cisnieniem.
Dodac do probki 50 μl roztworu trypsyny.
Przesacz rozdzielic do 6 probowek, a nastepnie delikatnie po sciance nawarstwiaxc roztwor zmrozonym alkoholem, tak aby utworzyla sie odrebna warstwa.
Po kilku minutach na granicy faz mozna zaobserwowac wytracone nici DNA.
Osad DNA nalezy przeniesc przy uzyciu pipety Pasteura do suchej probowki i przemyc zmrozonym alkoholem.
Odsciagnac roztwor alkoholu i wysuszyc osad przy uzyciu Speedvaca.
Elektrofereza fragmentow DNA
Przygotowac zel agarozowy poprzez ogrzanie 1% roztworu agarozy w buforze TAE w temperaturze 99oC na lazni wodnej przez okolo 15 minut ( do rozpuszczenia agarozy).
Wylac ostudzona do okolo 50oC agaroze do formy i poczekac do zastyganiecia zelu (okolo 10 minut).
Przygotowac probki do rozdzialu na zelu agarozowym:
Probka nr 1: dodac 30 μl buforu do probek i nastepnie wymieszac przy uzyciu Vortexa
Probka nr 2: dodac 5 μl roztworu enzymu restrykcyjnego. Inkubowac 5 minut, a nastepnie dodac 30 μl buforu do probowek i wymieszac przy uzyciu Vortexa.
Naniesc probki na zel w objetosci 20 μl.
Rozdzial elektroforetyczny prowadzic przy stalym natezeniu pradu 60V przez 5 minut, a nastepnie 100V przez 15 minut.
Przygotowac probki do rozdzialu na zelu poliakrylamidowym:
Probka nr 4: dodac 30 μl buforu do probek i nastepnie wymieszac przy uzyciu Vortexa
Probka nr 5: dodac 5 μl roztworu enzymu restrekcyjnego. Inkubowac 5 minut, a nastepnie dodac 30 μl buforu do probowek i wymieszac przy uzyciu Vortexa.
Probka nr 6 : inkubowac probke przez 5 minut na lazni ultradzwiekowej, a nastepnie dodac 30 μl buforu do probek i wymieszac przy uzyciu Vortexa.
Naniesc probki na zel w objetosci 20 μl.
Rozdzial elektroforetyczny prowadzic przy stalym natezeniu pradu 60V przez 5 minut, a nastepnie 100V przez 15 minut.
Barwienie zelu
Zel przeniesc do pojemnika wypelnionego roztworem barwnika i inkubowac 15 minut mieszakac na rotorze .
Zel orzemyc roztworem alkoholu 10% nastepnie woda.
Zaobserwowac roznice w polozeniach prazkow w poszczegolnych studzienkach.
12. Mendel
Dominant
Seed (Round, Yellow, Graycoat (red flower) )
Pods (Inflated Green)
Seed (Wirinkled, Green, Whitecoat (white flower) )
Pods (Pinched Yellow)
Stemps
Axial Flowers, Tall
Terminal Flowers, Short
utrzymujac sie w typie homozygoty
I prawo czystosci gamet
Jednostki dziedziczenie wniesione przez kazdego z rodzicow oddzielaja sie od siebie w czaseie tworzenia gamet przez mieszanie
P: AA x aa
F1: Aa
F2: AA, 2Aa, aa
13. Pojecia
Homozygota - posiada jednakowe allele tego samego genu
Gen - 2 allelow (Allellomorf) - Johansen 1909 (dunczyk)
Fenotyp - calosc informacji genetycznej danego organizmu, cechy, ktore powstaja przy wspoldzialaniu genotypu i srodowiska
Genom jadrowy
Genom mitochondrialny
Genom chloroplastow
Cecha dominujaca - przejawia sie w homo- i heterozygotujaca
Cecha recesywna - przejawia sie w postaci homozygotycznej
Allele - alternatywne formy tego samego genu powstajace w wyniku mutacji zajmujace to samo mutujace lacus (loci) w chromosomach homologicznych
Krzyzowka wsteczna (testowa)
AA x aa -> Aa
Aa x aa -> Aa, aa
Wspoldzialanie alleliczne
-pelna dominacja
-dziedziczenie posrednie - wystepuje wtedy gdy heterozygotyczna, wykazuje w fennotyczne posredni ch...
-wspoldominacja (kodominacja) - oba allele ujawniaja sie w fenatyczne
-overdominacja (naddominacja)
-dehydrogenaza 6-fosforanu
-hemoglobina posrednia - w cisnieniu niskim powstaja krysztaly
H^S - zagesta cytoplazimie
H^AS H^S - zageszczenie cytoplazimie
najlepszea heterozygota w okreslonych warunkach
W^+, W, W^a -> allele wielokrotne, oddnosi sie do populacji
C, c^ch, c^h, c
Pojedyncze geny:
-hydroksylaza fehyloalaninowa
-koenzym tetrahydrobiopteryny
-houskiping genes
-fenyloketonina
-muskowiscytoza
-alkopto...
-albinizm
-Hchondriplazga
-plasawica Huntingtona
-Brachydoktylizm
-Polidaktylizm
Fenylodoza -> kwas fenylopirogronowy
Fenylodoza -> Tyrozyna -> kwas p - hydroksyfenylopirogronowy -(tyronozaonaza) -> kwas homogentyzujacy -(alkoptomina)-> kwas malechoacetooctowy -> dalsze utlenienia
Fenylodoza i kwas fenylopirogronowy - zle dziala na system nerwowy -> uposledzenie
fenyloketonuria 48h - dieta -> gen latwo modyfikowane przez srodowisko, modyfikowane bialka pozbawione feryloalaniny - dieta do dojrzalosci, a jesli kobieta chce miec dziecko - do konca okresu rozrodczego.
Albinizm
- brak zdolnosci wytwarzania barwnika
- do glebszy partii biala moga sie przedstawic promienie UV
Alkaptonuria (czarne pieluchy)
- ciemnienie chrzastek i stawow
-opisana w 1902 przez A. Garrata (Anglik)
Mukowiscydoza
-smiertelna
-mutacja genetyczna bialka budujacego kananl dla jonow chlorkowych
- bardzo slony pot
- niszczenie nablonkow - oddechoweo, pokarmowego, plemnikotworczych - mezczyzni nieplodnii
- umiera sie powiklane drog oddechowych - sluz kwas deoksyrybozami
-uwaza sie ze Chopin zmarl na mukowiscydoze
Dominujace
Aclondrplozja (dlorwizm, karlowatosc) (D)
-glowne Dd , u DD w 20% dziedziczenia, 80% mutacji
-gen bardzo labilny
- wazny wiek ojca
- gen receptora czynnika wzrostu fibroblastow
Plasawica Huntingona
-neurodegeneracja
-taniec swietego Witta
-napady agresji najpierw - nieskorodynowane tanecznemu ruchowi
- ujawnienie sie w pelni ok. 40 roku zycia
Polidaktylia
-dodatkowy kciuk
Brachydaktelia
-skrocenie czlonow palcow
2 prawo mendla
P_0 AABB x aabb
P_1 AaBb
AB Ab aB ab
AB AABB AABb AaBB AaBb
Ab AABb AAbb AaBb Aabb
aB wc wc nc nc
ab wc wB nC nB
9 : 3 : 3 : 1
wc wB nc nB
2 prawo Mendla - cechy dziedzicza sie niezaleznie od siebie jezeli kazda z rozpatrywanych cechy uwarankuwanie jest przez pary alleli, z ktorych jeden byl dom, a drugi recesywny, bo obserwuje sie w pokoleniu F_2 rozszczepienie cech w stosunkach 9:3:3:1
liczba htero.. par alleli n
liczba gamet 2^n
liczba fenotypow w F_2 2^n
liczba genow 3^n
Wspoldzialnie sie alleliczne
a) komplementarne ( dopelniajacej sie)
b) epistatyczne
Plebaltyzm (bielactwo) - geny modyfikatory (geny tla) ( rozna ekspresja genu w zaleznosci od innych)
Dziedziczenie poligemiczne (cechy ilosciow
-sa odpowiedzialne za nie jest wiele genow
-krzywa Gausa (krzywa zmiennosci ciagla)
-allele recesywne dla tych cech sie neutralne, a dominujace
-warunkuja pomieszczenie cechy a jakas jednostke (zwykle ta sama jednostka)
Zjawisko transgresji
-przekroczenie typow rodzicielskich
-im plus lub minus
AaBbCc x AaBbCc C -10g
20g+30g 50g
np.
AABbCc 60 g transgresja im plus
AABbcc 50 g
aaBbcc 30 g transgresja im minus
Cechy ilosciowe - silnie podlegaja wplywa srodowiska
-miesnosc
-jakosc miesa
-niosnosc
Cechy ilosciowe
-inteligencja
-zachowanie
Franus Gatton - jesli bada sie uzaleznienia u czlowieka wieksze sonie ze ludzie uzdolne byci w rodzinie niz to wynika z rachunku prawdopowobienstwa
eugenika - nauka o polepszeniu populacji ludzkiej
-pozytywna lub negatywna
-wynik sterelizacji w wielu krajach
Laura Kaufman (polka) - wplyw srodowiska na genotyp, gen himalaja u krolika - barwa zalezna od temperatury wyluskiwala siersc przylozyla lub powstala barwa czarna
Norma - reakcji genu - zakres w jakim gen moze odpowiedz na modyfikujacy wplyw srodowiska
m. kompensacyjny - we wczesnym okresie rozwoju (marula, plastocysta0 z chromosomem x u samicy losowo ulega inaktywacji
X_ms - gen mozaikowosci- jego mutacja zwiazana jest z zaburzeniami w transporcie miedzi
mutacja leetalna - > choroba menkesa - umieraja glownie chlopcy zyja do 5 roku zycia
Zespol Turnera
-niski wzrost
-lekkie uposledzenie umyslowe -> przejaw rodzicach pietno genomu X od matki o
-platowata szyje
zespol Klinefellera
-mezczyna na 2n autosomach 1 chromosom X
-ma cialko 9-a) forma
-nieplodny - w czasie spermatojowy uaktywnia sie chromosom X
kotki tylko moga byc 3 kolorowe
PAR koniugacje
TDF - > testis deteminy fak.. -> rejony odpowiedzialny ze wytworzenie gamet meskich
czlowiek
koniuguja ze soba X i Y
w czasie gametogenezy niezbendno do prawidlowych konfiguraccyjne niewielkim odcinku PAR - rejon pseudoatosomalny -> odwraca sekwencje homologiczne -> moze tam dochodzic do crossing over
Tdy
xPAR
mysz
U czlowieka glebokie glebokie crossing - ktory poza rejon homologiczny moze sie zdazyc ze TDF przeniesie sie z Y na X.
SRY - sex otelerminig region of the X chromosom
Dawia Page - znakowanie geny na chromosomy Y PP1007
Wyplyw srodowisko wewnetrznego
Penetracja genu - srodowiska zewnetrznego zalezy czy sie gen ujawnic czy nie (pelna czy niepelna penetracja genu) -> odnosi sie do populacji
Ekspresja genu - natezenie cechy - przy mutacji Bar ( redukcja liczby ...) -> w zaleznosci temperatury
Trafill Lysenko - wyplyw srodowiska (kukurydza)
Wazne roztrzygniecie srodowisko-genotyp
-spelnienie
- z punktu jednostki
Inteligencja dziedziczona w 40%
Srodowisko matczyne -> tez ma wplyw
Rozmnazanie plciowe przewaza - mimo ze wydatek energetyczny jest wiekszy
Rekombinacja cech i utrwlenie sie
-mejoza - crosing over
-niezalezna regeneracja chromosomow
-losowe laczenie sie gamet
W bezplciowym - jedynym zrodlem zmiennosci sie mutacji.
Zmiennosc - pozwalaja przystosowac sie do warunkow ...
Rozmnazanie plciowe
I Sygnal wywolawczy
II Kaskada genow regulatorowych
III Geny bezposrednio odpowiedzialne za roznice plciowe
I
Srodowisko
Stosunek X/A ( do zespolu autosomow)
Obecnosc Y
Bihawioralny rozwoj -> ryba w srodowisku -> duno samiec rozmnasia siejako samica i na odwrot
Na poczatku zarodek nie jest zroznicowany plciowo -> sygnal wywolywany -> przestawienie rozwoju na plec nadrzedna
Dropshidia - stosunek X/A
2n != 8
Ab Xy XX
XX/2A = 1
X/2A = 0,5
Y - potrzebny do permatogenezy nie potrzebny do determinowania plci
bezwzgledu na ilosc X na Y
1 przypadek 4-5X i Y - dziewczynka i
Chromosomy determinuja plec u ssakow
X nie jest homologiczny do Y para kilkoma wypadku nie zawiera homohefun... genow.
mechanizm kompensacji - wyrownujacy dysproporcje u zawartosci genow pomiedz samcem i samica
SRy
- konserwatywny - na domenie
- HMG - high mobility group box
-80 aminokwasow
- ma zdolnosc laczenia sie z DNA
- czynnik transkrypcyjny
- ma zdolnosc nagrania czastki DNA
-SRY wygra
14.
100. Literatura
1) W. Gajewski "Genetyka ogolna i molekularna" PWN 1983
2) "Genetyka molekularna" - praca zbiorowa pod redakcja P. Weglenskiego PWN, W-wa 1996r.
3) S. Rogalska , J. Maluszynska, M. Olszewska "Podstawy cytogenetyki rosli" PWn, W-wa 1999
4) K. cliaron, M. Swironski "Genetyka zwierzat" PWN W-wa 2000
5) T.R. Brown "Genomy" PWN W-wa 2001
Komentarze
Prześlij komentarz